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第五章 PCR技术原理 PCR概念的提出 1983，Kary Mullis Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高温。 此酶具有以下特点： ①耐高温， ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。 ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在?1989?年，Science?将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子?(Molecule?of?the?year) ①模板：单链或双链DNA ②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 ④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂 4.PCR反应程序 ⑴94~96℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） ⑵94℃ 30’’ 变性 ⑶50-60℃ 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） ⑷72℃ n’(按1’扩增1kb计算）延伸 ⑹72℃ 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） ⑺4-10℃ 保存 1）复性和延伸温度 复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60℃ 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定（低于Tm 值2-3 ℃ ）。 延伸温度绝大多数设定为 72℃ 。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR 。 2）反应时间 变性一般使用 30 秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。 复性时间有 30 秒种一般是足够的。 延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。 3）循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为 25～35 次。 ????平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。 原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低 ，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。 4）PCR 反应液的配制 最后加入 DNA 聚合酶。 早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。 热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。 引物设计的一般原则 ④模板：单、双链DNA均可。 模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过 高会导致反应的非特异性增加。 ⑤DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。 Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 二、PCR的类型 1. 长片段DNA的PCR扩增 常规PCR长度为2kb以下。 长片段PCR扩增存在的问题： （1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低 （2）高温会损坏模板DNA和PCR产物 （3）高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解 （4）长片段DNA分子的变性比短片段困难，DNA聚合酶与模板DNA的趋近和接合变得困难 （5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发挥，从而限制产物的长度 改进： (1)改进缓冲体系 (2) 采用混合DNA聚合酶 主体使用扩增效率高，延伸能力强的Taq DNA聚合酶；少量使用具有3ˊ5ˊ外切酶活性的高温DNA聚合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。 2. PCR扩增未知DNA片段 1).染色体步查（移）（chromosome walking ）： 是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步获得与其相邻的未知序列的核苷酸组成的方法和过程。 步骤： 步骤： (1)基因组DNA的限制性内切酶酶切， （2）接头与限制性内切酶片段的连接， （3