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　　广州市登革1型病毒基因组测序及系统进化分析论文 文金生，江丽芳，晏辉钧 【摘要】 目的 ：对引起2002年广州登革热的登革1型病毒分离株（71/02GZ）进行全基因组测序和系统进化分析。方法：采用C6/36细胞培养71/02GZ，分别采用RT-PCR，5’RACE和3’RACE扩增基因组中编码区序列、5’和3’末端非编码区序列，PCR产物克隆到载体并测序，拼接成全基因组序列，分别基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt进行系统进化分析。结果：71/02GZ株基因组全长10 735 nt.freel plete genome sequencing and phylogeic analysis of a DENV-1 isolated (71/02GZ) strain ents in viral genome including 5’ terminal and 3’ terminal plified using RT-PCR，5’RACE and 3’RACE ；PCR product e， the phylogeic relationship of 71/02GZ isolates and other DENV-1 isolates e of 71/02GZ inal and 3’terminal NCRs e， shoembers of another genotype. In addition，71/02GZ strain ay be imported from Indonesia. Key orrhagic fever，DHF）/登革休克综合征（Dengue shock syndrome，DSS）。2002年DENV-1在广州市区引起1 423例患者发病2-4。与以往相比，此次大流行具有典型的特点：①流行持续时间长，各年龄组都有发病患者；②疫情来势凶猛，爆发点多，涉及面广；③本次流行是历史上在广州市区内发生的规模最大的一次。因此，阐明此次流行登革病毒株的可能来源对于登革的预防、控制以及疫苗的研发具有重要的指导意义。本研究拟采用RT-PCR，5’RACE和3’RACE等技术对本次流行时分离的一株DENV-1（71/02GZ） 进行全序列测定，并基于全基因组序列、E基因序列和E/NS1连接区240 nt，使用Mega 4.0软件进行系统进化分析。 1 材料和方法 1.1 病毒株 71/02GZ株于2002年自广州1例DF患者血清中分离（采用C6/36细胞），型特异性RT-PCR检测证实其为DENV-1。71/02GZ株冻存于液氮中。 1.2 引物设计与合成 参考DENV-1的Singapore S275/90株(GenBank Accession Number：M87512)和1998年印度尼西亚分离株(GenBank Accession Number：AB189121)，利用Primer premier 5设计扩增编码区的13对引物，5’非编码区（NCR）下游引物，3’NCR上游引物，引物由Invitrogen公司合成，引物见表1。 1.3 病毒RNA的提取及逆转录 将71/02GZ接种到长成单层的C6/36细胞，2～3 d后，当细胞病变（CPE）出现（+++）时，收集细胞及培养液用于提取RNA。0.2 mL病毒液加入1 mL Trizol，混匀，室温10 min。加入氯仿0.2 mL，振动15 s，室温10 min。 4 ℃ 12 000 次/min，离心15 min。 吸取上清，加入异丙醇0.5 mL，室温10 min。4℃ 12 000 g/min，离心15 min。去上清，加入冷冻的75%乙醇1 mL洗涤1次。4 ℃ 7 500 g/min，离心10 min。去上悬液，空气干燥。用DEPC处理水溶解RNA沉淀。总RNA 5μL＋DEPC处理水34μL＋下游引物（25μmol/L）2μL。65 ℃ 55 min。加入10×Buffer 5μL，10 mmol/L dNTP 2μL，RNA酶抑制剂1μL，逆转录酶1μL。42 ℃ 1 h，90 ℃ 5 min。 1.4 编码区的扩增、克隆和测序 50μL（EX Taq酶0.25μL，10×Buffer 5μL，cDNA 5μL，20 mmol/L上游引物1μL，20 mmol/L下游引物1μL，DEPC处理水 37.75μL），94 ℃ 3 min，35个循环（94 ℃ 50 s，退火温度 1 min，72 ℃ 1 min），72 ℃ 7 min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳，将含有目的条带的凝胶切下，采用PCR产物回收试剂盒回收。 PCR回收产物克隆入pMD18-T载体，转化DH5α感受态细菌，提取质粒PCR鉴定以