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电子克隆简介 南京农业大学生命科学学院 沈文飙 什么是电子克隆 拼图游戏一样的原理 应用 如何做拼图游戏 常用软件及网络资源简介 优点与缺点的讨论 现状与展望 什么是电子克隆 Watson Crick 成功解析了DNA分子二级结构，开创了分子生物学时代 Karry Mullis 发明了PCR反应，体外大规模、有目的和快速地克隆目标基因成为可能 信息科学技术特别是数据库技术在战后飞速发展 什么是电子克隆 表达序列标签（expressed sequence tags，EST）是对某个基因cDNA克隆测序所得的部分序列片段，长度大约为200~600bp 由于基因表达调控作用不同，同一个基因的mRNA剪接位点和方式不同，所以同一个基因的全长cDNA可能包含多个EST EST既代表了基因cDNA的某一区段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式 什么是电子克隆 电子克隆技术是生物学数据库中EST数据库、核酸序列数据库、基因组数据库，采用同源性序列比对和归类分析、重叠区域组装和拼接等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的全长cDNA，根据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读框两端的引物，进行RT-PCR克隆出相应基因的方法 什么是电子克隆 传统的克隆方法是利用基因特异性引物大量扩增cDNA末端或构建cDNA文库并采用原位杂交进行筛选，实验进程长、步骤繁琐、成本高、得率低；运用电子克隆的方法延伸得到的cDNA几乎囊括了所有疑似为目的基因的cDNA序列，无论表达转录如何调控，都能通过PCR扩增出表达的那一段基因 传统的方法如同小规模地捕捞一条或几条鱼，电子克隆与之相比就如同集约化地捕捞一群鱼 拼图游戏一样的原理 相近的物种在核酸序列上有相似性，相近物种中的同源基因序列在一定程度上可以代表目的基因的序列 可代表程度与两序列的相似度直接相关，加之遗传密码的简并性，这种混同在理论上是可行的 ，但需要作同源性检验以克服主观因素的影响 拼图游戏一样的原理 借助计算机找到具有相同或相似图案的图块，拼成完整的图案，我们需要做的是进行局部的微调。 剩下的工作就是对拼接出的cDNA进行可能的开放阅读框的分析，设计囊括开放阅读框两端的引物，RT-PCR扩增侯选基因 应用 电子克隆主要应用于两个方面： 一个是利用EST序列检索同源性序列，并由此拼接cDNA序列以期挖掘新基因 另一方面是在全基因组已经测序的物种中，研究整个基因组序列以推测其中可能尚未发现的基因 目前应用比较广泛的是第一方面 应用 数据库查询 数据库比对 文件下载 序列分析 序列装配 分子模型 结构分析 功能分析 应用 在全基因组已经测序的物种中推测新基因的步骤如下： 分析和定位开放阅读框 虚拟翻译并对多肽链序列检索比对 可靠性检查 分析与之相关的调控序列 如何做拼图游戏 以电子克隆新的水稻过氧化氢酶（catalase，CAT）基因为例，简介延伸cDNA的流程： 以登录号为CA759712的EST在对其在核酸序列数据库中进行BLAST检索比对时，发现登录号为CB652681的序列推测为水稻CAT基因的部分序列，与信息标签 EST具有比较高的同源性，该EST序列将作为种子序列 如何做拼图游戏 将检索得到的同源序列保存到PC机上，运行DNAStar软件包，将上述序列输入，由于基因测序是借助质粒载体完成的，序列中难免混有载体序列，因此需要运行程序查找载体序列，对序列进行末段修剪去掉冗余部分 如何做拼图游戏 程序根据外显子和内含子的编码规则和排布方式搜索和定位开放阅读框，开放阅读框是电子克隆的重点研究对象；接着，程序对各段序列的重复序列和差异序列进行逐一检索和比对，并对重叠区域进行拼接和组装，构建重叠序列群 以上各步骤由程序自动完成 如何做拼图游戏 以构建的重叠序列群为信息标签，进一步检索比对，搜索其高度同源序列 如果发现了与之高度同源的未知序列，则重复上述步骤；若没有新的发现，说明拼接组装得到的EST可能囊括了所以可能的目的基因序列 根据以上步骤，得到了一个全长为1678 bp的EST序列 如何做拼图游戏 以此EST序列为cDNA序列，对其设计囊括整个开放阅读框的特异性引物，设计得到的上游引物为：5’-CTA-GCC-CAC-TAC-CAT-GGA-TCC-TTG-3’，下游引物为：5’-CAG-AAT-TTC-TGT-AGC-CTT-GCT-GAT-3’， 引物的具体合成可交由经营分子生物学相关产业的公司商业化合成 如何做拼图游戏 对延伸出的cDNA其作人工的可靠性验证 提取水稻中总RNA，进行RT-PCR，电泳检测结果 转录调控的研究 常用软件及网络资源简介 DNAStar是一款电子克隆中常用的软件包，它以