细胞考试终稿.pptVIP

小组成员（按学号）：丁明辉、庞会宁、王玉佩 詹 彬、李乐萌、肖 健 2006年8月，Takahashi等明确了Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4这四种转录因子的导入可以将已成熟的大鼠皮肤成纤维细胞重编程为诱导性多功能干细胞(iPSCs)。尽管所得iPSCs不具胚胎干细胞所有功能，但具有胚胎干细胞的经典的物理性质、生长方式和遗传学特征。而且这种技术对于已有的Somatic cell nuclear transplantation、Cell–cell fusion和Treatment with extracts of pluripotent cells已分化细胞重编程技术而言，是具有突破性意义的。 Oct4: Yamanaka, Shinsuke Ito等人发现:Oct4位于小鼠第17号染色体上，在MHC内或临近MHC处。Oct4是迄今人们发现最早也是最重要的维持胚胎干细胞多潜能性和自我更新的关键基因，其表达产物能够参与许多基因的调节。同时它是一种精细的调节因子，研究发现，Oct4基因表达量的升高或降低，都会引起胚胎干细胞的分化。并且，其靶基因的调节原件常常接近于Sox2蛋白DNA结合位点。 Sox2： Sox2是(SoxSry-related HMG box-containing)基因家族的成员(The transcription factor Sox2 )。小鼠的Sox2基因位于第3号染色体上。Sox2对于维持胚胎干细胞的未分化状态至关重要，他常常与其他调节因子一起协同作用，如Nanog、Oct4。 事实上，Wei Z, Yang Y研究发现Klf4能够和Oct4、Sox2形成复合物。Oct4在与Sox2协同作用时，也能形成Oct4/Sox2/DNA复合物，我们的实验将对Oct4与Sox2是否发生直接相互作用进行研究。 Tet1: Tet1是Tet家族的成员(包括Tet1，Tet2，Tet3)。Tet蛋白在维持多功能干细胞的多功能上扮演了一个重要的角色。其在维持多功能干细胞多功能性上起的作用可以下图表示： 而Tet1蛋白在Tet蛋白家族中也是举足轻重。Tet1蛋白的DNA结合位点在Nanog的启动子附近，这表明它与这一类与维持干细胞多功能性有关的调节因子紧密相关。同时它还有其他的重要功能，如Tet1,2能够将5’-甲基胞嘧啶转化为5’-羟甲基胞嘧，以及Tet1与DNA甲基化有关。Shinsuke Ito等人研究发现Tet1的缺失能够导致多功能干细胞生长速率降低，我们的实验中对Tet1对Oct4和Sox2的作用进行了研究。 Tet DNMT Nanog expression ES cell self-renewed 本组实验目的： 1、研究敲除Tet1基因是否能使Oct4与Sox2表达量降低。 2、运用Western blot技术研究Oct4蛋白与Sox2蛋白之间是否能形成复合物起到调节作用。 本组实验内容： 实验一：Tet1 Knockdown对Oct4和Sox2的影响 实验二：免疫共沉淀法探究Oct4和Sox2相互作用 一、实验方法与步骤： （一）小鼠ES细胞培养： 1、材料、试剂及仪器： (1)GMEM (2)热失活牛胎血清 (3) GIBCO (4) L-谷氨酰胺 (5) MEM非必需氨基酸 (6) 青霉素 (7) ESGRO(Chemicon) (8)小鼠E14Tg2A ES细胞(ATCC) (9)恒温培养箱 2、实验步骤： 配制格拉斯哥极限必须培养基(GMEM)，加至终浓度15% 热失活牛胎血清、55μL GIBCO(β-巯基乙醇)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM MEM非必需氨基酸、5000 unit/ml 青霉素和1000 unit/ml ESGRO。培养小鼠E14Tg2A ES细胞。 （二）Tet1 knockdown: 1、材料、试剂及仪器： (1)试剂盒(Lipofectamine? RNAiMAX) (2)CONT KD(control knockdown)、Tet1 KD1、Tet1 KD2 siRNA (sbs)