CTAB法提取RNA.pptxVIP

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2017-06-16 发布于河南
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CTAB法提取RNA.pptx

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CTAB法提取RNA

准备工作 1.CTAB 试剂 1.8M Licl 25ml:称Licl8.478g,用ddH2O定容至25ml 2.2M NaAc（PH4.8）50ml:称NaAc 8.203g,用ddH2O定容至50ml,用冰醋酸调PH 3.3M NaAc （PH5.2） 50ml:称NaAc 12.305g,用ddH2O定容至50ml,用冰醋酸调PH 4.2﹪CTAB 步骤 1. 取叶片材料两克，液氮中研磨成细粉末 2.每管加入900ul65℃预热的CTAB提取液和45ulβ巯基乙醇，剧烈涡旋匀浆，65℃水浴30min，每5分钟摇匀一次 3.冰盒上，每管加入900ul氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴10min。4℃、12000rpm 、10min离心 4.移上清至新2ml RNase-free管，加入1∕3体积的8M LiCl和25ul β-巯基乙醇，-20℃沉淀过夜 5.样品从-20℃移至-70℃，30min后自然解冻 6 .4℃、13000rpm、30min离心 7.弃上清，沉淀用600ulTrizol溶解，混匀，室温静置5min，加入120ul2M Na Ac (pH4.8),混匀后加入600ul的酸性酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），涡旋混匀，水浴10min，4℃、12000rpm、15min离心 8.取上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），涡旋混匀，冰浴10min，4℃、12000rpm、15min离心 9.取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴5min，4℃、12000rpm、10min离心 10.重复9 10.取上清，加入1∕3体积的3M NaAc(pH5.2) 和2.5倍体积的无水乙醇（预冷），-70℃放置30min 11.样品从-70℃移出后自然解冻℃ ，4℃、 13000rpm、15min离心 11. 弃上清，每管加300-1000ul75%乙醇（预冷），混匀，水浴5min 12. 4 ℃、 13000rpm、15min，去上清 13.重复11、12 14.室温8000rpm 、10min离心除乙醇（上清） 15.室温干燥10min,加20-25ulDEPC水，保存于-70℃ 11.加入100l RNase-free-ddH2O溶解沉淀。取10稀释200倍检测UVλ230、260、280下的OD值，检测RNA样品的纯度与浓度。取5μg进行RNA样品的电泳检测（电泳见图1.1），以检测 RNA的完整性，其余样品加入3倍体积的无水乙醇于－70℃下保存。