生化实验04-粉酶活性的测定-陈桃.pptVIP

* * 相关知识点回忆 NRE RE 直链淀粉 支链淀粉或糖原分支点的结构 RE NRE ?(1?6)分支点 支链淀粉或糖原分子示意图 直链淀粉的螺旋结构 0.8nm 1.4nm 6个残基 1. 重要的多糖-淀粉 支链淀粉的分枝结构 开始分枝的残基 非还原端残基 两个葡萄糖单位之间的1，6-糖苷键 两个葡萄糖单位之间的1，4-糖苷键 a -淀粉酶 β-淀粉酶 切α-1,4-糖苷键 淀粉的 水解 麦芽糖酶 酶促 脱支酶 切α -1,6-糖苷键 降解 异麦芽糖酶 磷酸解: 淀粉磷酸化酶 2、淀粉的酶促降解 3. 淀粉的酶促水解 淀粉酶 α－淀粉酶：在淀粉分子内部任意水解α-1，4糖苷键。产物为麦芽糖，麦芽三糖，糊精等还原糖（内切酶） β－淀粉酶:从非还原端开始，水解α－１，4糖苷键，依次水解下一个β－麦芽糖单位（外切酶） α－淀粉酶 β－淀粉酶 极限糊精 　　　α-淀粉酶 　 　　　　 β-淀粉酶 可跨越分枝点 　　　 不能跨越分枝点 内切酶（随机切） 　　 端解酶（非还原端两两相切） 产物糊精分子量小 　　糊精分子量大（极限糊精） 耐70℃ 15min, 不耐酸 　 耐pH=3.3 酸性, 不耐高温 分布 发芽种子 休眠种子 α-淀粉酶和β-淀粉酶的异同点： 相同点：都作用于α-1,4糖苷键，产物都是麦芽糖 不同点： 实验04 一、目的 二、原理 淀粉 α-淀粉酶（内切酶） β-淀粉酶（外切酶） 麦芽糖等寡聚糖 麦芽糖 3，5-二硝基水杨酸 3-氨基-5- 硝基水杨酸 （棕红色） 淀粉酶的作用机制及产物显色原理： D-麦芽糖 淀粉酶活性大小的表示方法： 淀粉酶活性的大小与产生的还原糖的量成正比。以单位质量样品单位时间生成的还原糖的量表示。 测定α-淀粉酶和β-淀粉酶： α-淀粉酶不耐酸， β-淀粉酶不耐热，本实验采用70。C保温15min钝化β-淀粉酶而测出α-淀粉酶。总活力减去α-淀粉酶活力则为β-淀粉酶活力。 三、材料、仪器设备及试剂 材料：萌发的小麦种子（芽长1cm） 仪器设备：分光光度计、恒温水浴、刻度试管、 容量瓶 试剂： 1、标准麦芽糖溶液（1mg/mL） 2、3，5-二硝基水杨酸（含NaOH） 3、1%淀粉溶液 四、实验步骤 2、酶液制备 称取1g萌发的小麦种子 加少量蒸馏水 研磨  转入100 mL容量瓶 定容 放置15min  过滤 淀粉酶原液（酶液Ⅰ） 取酶液Ⅰ 10 mL于50 mL容量瓶，用蒸馏水定容 至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液（酶液Ⅱ） 1、麦芽糖标准曲线的制作 A540=0.264x-0.052 (x为mg麦芽糖） 3、酶活力的测定 取4支干净的具塞刻度试管，编号，按下表操作： 摇匀，沸水浴中5min，取出流水冷却，加蒸馏水至20mL。摇匀，540nm比色测定。 操作项目 管号  Ⅰ-1 Ⅰ-2 Ⅱ-1 Ⅱ-2 淀粉酶原液（酶液Ⅰ）/mL 1.0 1.0 0 0 钝化β-淀粉酶 置70 0C水浴中15min，取出后流水冷却 淀粉酶稀释液（酶液Ⅱ）/mL 0 0 1.0 1.0 3，5-二硝基水杨酸/ mL 2.0 0 2.0 0 预保温 40 0C恒温水浴中保温10min 1%淀粉溶液/ mL（ 40。C ） 1.