基因工程的酶学基础.pptVIP

第二章 基因工程的酶学基础 第一节 　限制性内切核酸酶—“分子手术刀” 第二节 　DNA连接酶——“分子缝合针” 第三节 　DNA聚合酶和反转录酶 第四节 　DNA 修饰酶 第五节 　外切核酸酶 第六节 　单链内切核酸酶 第七节 　ＲＮＡ酶 核酸酶(nucleases):是指通过切割相邻两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，使核酸分子发生水解断裂的酶。 按底物不同分为： DNA酶（DNase ） RNA酶（RNase ） 底物非专一性核酸酶 按作用部位不同分为： 5′末端外切酶 核酸外切酶 3′末端外切酶 核酸内切酶 第一节 限制性核酸内切酶 .切点： 1. 来源 限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。 修饰：细菌自身的DNA碱基被甲基化酶修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 二、限制性内切核酸酶的类型 1. I 型限制性内切酶 1968年首先由M. Meselson和R. Yuan在从大肠杆菌 B株和 K株分离的 如 EcoB和 EcoK （1）识别位点序列 未甲基化修饰的特异序列 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC （2）切割位点 在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链 首先由美约翰·霍布金斯大学的H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来 分离的第一个酶是Hind Ⅱ （识GTC GAC） （1）识别位点序列 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）, 与DNA的来源无关 （2）切割位点 识别位点处切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）如： EcoR I 5’-G?AATTC-3’ 3’-CTTAA?G-5’ Pst I 5’-CTGCA?G-3’ 3’-G?ACGTC-5’ 产生粘性末端 （3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端 分两种类型：  ① 5’端凸出（如 EcoR I切点） 三、限制性内切核酸酶的命名 四. Ⅱ型限制性内切酶的基本特性 Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能 （二）切割位点的特异性 五、影响限制性内切酶活性的因素 DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ug DNA。 3. DNA的甲基化程度 4. 酶切反应的温度 5. DNA分子的构型 6. 缓冲液(Buffer) 高浓度甘油 Ava I 、Ava Ⅱ、Pst I、Xba I 碱性PH值 Avi Ⅱ、Mst I 低离子强度 Ape I 低盐浓度 Bst707 I 低PH值 Psh B I Mn离子存在 Hind Ⅲ 、Sfi I β-巯基乙醇 +低离子强度 Ava Ⅲ 高浓度甘油+ Mn离子存在+低离子强度 Bam H I EcoR I 六. 限制性内切酶对DNA的消化 内切酶与识别序列的结合模式 1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合 ① 在相同的缓冲液中反应同时进行 酶解过程 配酶解体系 混匀 反应终止 酶解结果鉴定 ① 酶解体系 ② 混匀 ③反应终止 ④ 酶解结果鉴定 几种常用限制酶识别位点 第二节 DNA 连接酶 根据连接反应所需的能量辅助因子： 一类是依赖ATP的DNA连接酶； 另一类是依赖NAD的DNA连接酶。 根据来源： T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶