第二章细胞的破碎.pptVIP

细胞破碎技术 第二章 细胞破碎技术 第一节 细胞壁的结构与组成 第一节 细胞壁的结构与组成 第一节 细胞壁的结构与组成 第一节 细胞壁的结构与组成 第一节 细胞壁的结构与组成 第一节 细胞壁的结构与组成 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第二节 细胞壁的破碎 第三节 包涵体 第三节 包涵体 第三节 包涵体 第三节 包涵体 第三节 包涵体 第三节 包涵体 一、包涵体的形成、分离及洗涤 形成包涵体的因素主要有以下几个方面： ①重组蛋白的表达率过高，超过了细菌的正常代谢，由于细菌的蛋白水解能力达到饱和，导致重组蛋白在细胞内沉淀下来； ②由于合成速度太快，以致没有足够时间进行肽链折叠，二硫键不能正确配对，导致重组蛋白溶解度变小； ③与重组蛋白的氨基酸组成有关，一般说含硫氨基酸越高越易形成包涵体； ④重组蛋白是宿主菌的异源蛋白，大量生成后，缺乏后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶及分子伴侣等，导致中间体大量积累导致沉淀； ⑤与重组蛋白的本身的溶解性有关； ⑥在细菌分泌的某个阶段，蛋白质间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体形成。 由于重组蛋白形成包涵体，包涵体又位于细胞质中，因此可选择破碎细胞的方法，得到包涵体。例如人γ—干扰素的提取中，先把发酵液冷却至10℃以下，离心（4000r/min）分离，除去上层清液，得到菌体，将细胞悬浮于10倍体积PBS缓冲溶液中，于冰浴下进行超声破碎，反复5次，每次5s，离心（4000r/min）分离后，用0.1%TritonX-100的溶液充分搅拌均匀，进行洗涤。洗涤三次后，离心（10000r/min20分钟），可得到包涵体。细胞破碎后离心分离的包涵体沉淀物中，除目标蛋白质外，还有其他蛋白质、核酸等的存在，经过洗涤，可以除去吸附在包涵体表面的不溶性杂蛋白、膜碎片等，达到纯化包涵体的目的。洗涤多采用较温和的表面活性剂（如TritonX-100）或低浓度的弱变性剂（如尿素）等。洗涤剂的浓度非常重要，通常不要太高，以免包涵体也发生溶解。 二、包涵体的变性溶解 包涵体中不溶性的活性蛋白产物必须溶解到液相中，才能采用各种手段使其得到进一步纯化。一般的水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性的方法才能使其形成可溶性的形式。常用的变性增溶剂有十二烷磺酸钠（SDS）、尿素、有机溶剂（乙腈、丙酮）、pH＞9.0的碱溶液或盐酸胍等。 十二烷基磺酸钠（SDS）是曾经广泛使用的变性剂。它可在低浓度下溶解包涵体，主要是破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。但是结合在蛋白质上的SDS分子难以除去。一般SDS的使用浓度为1%～2%（w/v）。 * * 第一节 细胞壁的结构与组成 第二节 细胞壁的破碎 第三节 包涵体 细胞壁是微生物菌体比较复杂的结构。不仅取决于微生物的类型，还取决于培养发酵液的组成、细胞所处的生长阶段、细胞的存储方式以及其它一些因素。不同微生物菌体细胞壁的结构有一定差异。 一、细菌 细菌的细胞壁坚韧而有弹性，由不同的肽链结合组成质量均匀的网状结构，其厚度因细菌不同而有差异，可抵御外界的机械损伤，并可承受细胞内强大的渗透压而不被破坏。 细胞壁的主要成份是肽聚糖，由N—乙酰葡糖胺（见图2-1a）和N—乙酰胞壁酸（见图2-1b）构成双糖单元，以β（1-4）糖苷键连接成大分子。N—乙酰胞壁酸分子上四肽侧链，相邻葡聚糖纤维之间的短肽通过肽桥或肽键连接起来，组成机械性很强的网状结构，像胶合板一样，粘合成多层。各种细菌细胞壁酞聚糖结构均相同，但在四肽侧链的组成及其连接方式上随菌种不同而有差异。 革兰氏阳性菌细胞壁（见图2-2）较厚，约20～80nm。含15～50层肽聚糖片层，每层厚度1nm，约占细胞干重的50%～80%。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。 图2-1 细菌细胞壁的主要组分 革兰氏阴性菌细胞壁（见图2-3）细胞壁较薄，有1～2层肽聚糖片，在肽聚糖层外尚有脂蛋白、脂质双层、脂多糖三部分