一代测序、高通量测序等各种测序相关概念介绍.pdfVIP

什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing ，HTS ）是对传统 Sanger 测序（称 为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测 定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS ) 足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行 细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing) 。 什么是 Sanger 法测序（一代测序） Sanger 法测序利用一种 DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到 掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个 反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核 苷三磷酸 (ddNTP)。由于 ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-OH 基团，使延长的寡聚核苷 酸选择性地在 G、A、T 或 C 处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTPs 和 ddNTPs 的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链 终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨 率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用 X-光胶片放射自显影或 非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing ） 全 基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体 水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致 病突变研 究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段 文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平 上检测疾病关联 的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具 有重大的科研和产业价值。 什么是 de novo 测序 de novo 测 序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物 种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种 的基因组图谱。获 得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。 随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大 大降低，大规模基因组 测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革 命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力， 可以高效、低成本地测定并分 析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing ） 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域 DNA 捕捉并富集后 进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低， 对研究已知基因的 SNP、Indel 等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异 如染色体断裂重组等。 什么是 mRNA 测序 （RNA-seq） 转录组学（transcriptomics）是在基因组学后新兴的一门学科，即研究特定细 胞在某一功能状态下所能转录出来的所有 RNA （包括mRNA 和非编码 RNA）的类型 与拷贝数。Illumina 提供的 mRNA 测序技术可在整个 mRNA 领域进行各种相关研 究和新的发现。mRNA 测序不对引物或探针进行设计，可自由提供关于转录的客 观和权威信息。研究人员仅需要一次试验即可快速生成完整的 poly-A 尾的 RNA 完整序列信息，并分析基因表达、cSNP、全新的转录、全新异构体、剪接位点、 等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。简单的样品制备和数据 分析软件支持在所有物种中的 mRNA 测序研究。 什么是 small RNA 测序 Small RNA （micro RNAs、siRNAs 和 pi RNAs）是生命活动重要的调控因子，在 基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。 Illumina 能够对细胞或者组织中的全部 Small RNA 进行深度测序及定量分析等 研究。实验时首先将 18-30 nt 范围的 Small RNA 从总 RNA 中分离出来，两端分 别加上特定接头后体外反转录做成 cDNA 再做进一步处理后，利用测序仪对 DNA 片段进行单向末端直接测序。通过 Illumina 对 Small RNA 大规模测序分析，可 以从中获得物种全基因组水平的miRNA 图谱，实现包括新miRNA 分子的挖掘，