第六章 基因芯片技术.ppt

98-10-23 二、分子生物学的发展为核酸序列分 析与测定提出的新要求 速度快、效率高 可同时对大量核酸序列进行检测和分析 操作简便、自动化程度更高 总体效率较常规杂交方法高 三、基因芯片的基本概念及发展经过 基因芯片(Gene chip) 又称DNA芯片（DNA Chip）或生物芯片(Biological chip，不过该词尚包括肽芯片等其它类型),它是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析。 早在八十年代初有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因组大量的遗传信息进行分析和检查，但直到光引导原位合成(light-directed in situ synthesis)高密度探针技术和激光共聚焦显微扫描问世之后才使该设想逐步成为现实，并迅速应用到分子生物学的多个领域，得到了科学界的高度重视。 四、基因芯片技术与传统杂交检测方式的比较 六、基因芯片相关技术 硬件： 序列合成设备包括：核酸或多肽合成仪（作预合成点样用）、照相平板印刷及半导体制作相应设备（作光引导原位合成）。 激光共聚焦显微扫描设备：激光共聚焦显微镜或相应设备，以采集高密度点阵杂交信号并进行数字化处理分析。 软件 基因序列分析及探针筛选技术（可能涉及专利等产权问题） 序列合成及定位技术（光引导原位合成或微量点样技术） 杂交信号的采集和分析技术（需要处理极大量的杂交信号并能由此得到所需信息） 七、基因芯片当前研究状况 现在全世界已有十多家公司专门从事基因芯片的研究和开发工作，而且已有较为成型的产品和设备问世。这些公司主要以美国的Affymetrix公司为代表，该公司聚集有多位计算机、数学和分子生物学专家，其每年的研究经费在一千万美元以上，且已历时六七年之久，拥有多项专利。产品即将或已有部分投放市场，产生的社会效益和经济效益令人瞩目。详情如下表所示： 世界十大基因芯片研制单位简要情况一览 续表 八、基因芯片的主要类型 九、基因芯片检测原理及简要过程 基本过程 用生物素标记并经扩增（也可使用其它放大技术）的靶序列或样品然后再与芯片上的大量探针进行杂交 用链霉亲和素(streptavidin)偶联的荧光素（常用的荧光素还有lassamine 和phycoerythrin）进行显色 图象的采集用落射荧光显微镜(epifluorescence microscope)、激光共聚焦显微镜或其它荧光显微装置对片基扫描 由计算机收集荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。 　　由于完全正常的 Watson-Crick配对双链要比具有错配(mismatch)碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性，所以，前者的荧光强度要比后者强出5-35%。从这一点来说，该检测方法是具有一定特异性的，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。以下图为例。 十、探针的合成与固定 光引导原位合成 (Light directed in situ synthesis） 操作过程（见下图） 使支持物氨基化 用光不稳定保护基（photo labile protecting group）将NH2基保护起来 选择适当的挡光板（mask）使需要聚合的部位透光，不需发生聚反应的部分不透光。这样，光通过挡光板照射到支持物上，受光的部分NH2解保护 合成所用单体分子一端按传统固相合成方法活化另一端则受光敏保护基团保护。这时，用单体分子去和支持物上解保护的氨基反应，偶联后的部位将仍旧带上保护基团。 类似地，进行以后其它反应直至得到目的寡聚体序列。 光引导原位合成技术原理图 预合成点样技术（Off-chip synthesis) 这一方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的DNA或蛋白固相合成仪进行。多聚物合成后再用特殊的点样装置或仪器（如美国Cartesian Technologies公司的PixSys NQ/PA系列产品）将其以较高密度分布于硝酸纤维膜或经过特殊处理的玻璃片上，点阵密度可达到2500spots/cm2（Yershov et al报道点阵密度最高可达20,000-30,000spots/cm2）。 十一、光引导原位合成和预合成点样技术的比较 十二、光聚合技术存在问题及解决方案 不同去保护方式对聚合效果的影响 十三、光敏抗蚀技术 　　　为此，Glenn McGall等将光引导合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相合，以酸作为保护剂，使探针密度达到16,000　spots/cm2以上（有望接近106spots/cm2）。 　　　光具有波粒二象性，所以具有衍射的特性。当挡光板透光孔间的距离足够小的时候，由于光的衍射，使受光部分与非受光部分光照对比度下降，