LAMP实验简介医.docVIP

通过LAMP实现DNA的线性扩增 LAMP 原理 60-65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。LNMP 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3 末端的Fl区段为起点。以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。 第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。LNMP 二、实验流程 阶段实验及需要解决的问题 (一) 实验准备阶段 1、引物设计 2、模板中引入合适的酶切位点 3、不同梯度拷贝数模板的准备 4、反应仪器的准备 5、具有链置换活性的DNA聚合酶的选择 6、扩增产物的检测方法 7、扩增产物量的检测 (二) 实验阶段 1、反应体系的确定 2、模板浓度的优化 3、反应时间的优化 4、扩增产物的检测 5、以PCR的扩增作为对照 具体实验方案 (一) 引物的设计 LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要导入靶基因就能自动生成成组引物。LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3 端的F3c、F2c和Flc区以及5 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构的形成，Tm值等在进行LAMEP引物设计的时候有以下几个关键点需要考虑：引物之间的距离 　　F2区段的5’端到B2区段的5’端(LAMP反应扩增的区域)之间的距离建议是120~180bp。 F3区段的3’端到F2区段的5’端之间的距离是0~20bp(同理B2和B3之间的距离是0~20bp)。 F2区段的5’端到F1区段的5f端(形成环的部分)之间的距离是40~60bp。 引物的T值 　　Tm值LNMP学习 HP-F： CGCGAGGTACCGAGCTCGTAAAACGACGGCCAGTGAATTC F： M13-47. HP-R： GGCCTGCATGCAAGCTTGCAGCTATGACCATGATTACGC R： M13-48. ] (二) 引入合适的酶切位点 方便扩增产物酶切后长度单一化。 (三) 聚合酶和反应温度的选择 用Bst聚合酶在60、63和65三个梯度温度下进行扩增，用Phi29聚合酶在37进行扩增，在其他因素相同的条件下，比较两种酶的扩增效率，选取最优的聚合酶以及该聚合酶最佳的反应温度。 (四) 最佳反应时间的选择 同样的条件下设置几个平行反应，分别在15min、30min、45min、60min、75min后通过琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果。. (五) 延伸反应 1、反应体系 (1) 反应体系的配制（25ul） FIP 0.8uM BIP 0.8uM F3 0.1uM B3 0.1uM Each dNTP 400uM betain 1M Tris-HCL 20mm KCL 10mm (NH4)2SO4 10mm MgSO4 4mm Triton X-100 0.1% Target DNA (2) 变性退火 将上述反应体系（除酶外）在95℃加热5min后，冷却，再加入8U Phi29 DNA 聚合酶 (3) 等温延伸 参63℃保温延伸一定时间 (4) 终止反应 在高于80℃的温度下加温2min，终止反应。 (六) PCR 表1 PCR Mix配制 加入量 10 ×PCR buffer 5ul d NTP 1