第3课 实验二 基因克隆(一).pptVIP

实验二 基因克隆（一） 基因组DNA的提取和限制性内切酶酶切分析 实验目的 掌握基因组DNA制备的原理和方法 了解DNA限制性内切酶作用特点和酶切消化的操作步骤 实验原理 1. 基因组DNA的提取和纯化 真核生物染色体DNA组装不同层次的结构 核酸分离、纯化原则 保持核酸分子一级结构的完整性； 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 ； 无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应去除RNA分子）； 基因组DNA制备的基本思路 匀浆组织，破碎细胞 去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子 沉淀核酸 去除盐类、有机溶剂等杂质 纯化干燥 溶解 蛋白酶K和SDS破碎细胞 在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分子分离，EDTA抑制细胞中DNase活性，蛋白酶K将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。 酚/氯仿抽提去除与DNA结合的蛋白质 酚是很强的蛋白质变性剂，氯仿能加速有机相与水相分离，溶解去除残留的酚，且可以去除蔗糖等，在氯仿中加入少量异戊醇可减少蛋白质变性过程中产生的大量气泡。 乙醇和醋酸钾沉淀核酸 核酸为水溶性，在有机溶剂和高盐存在下，核酸在水中的稳定性被破坏，呈不溶状态而沉淀下来。 注意事项 尽量在低温下进行操作； 避免物理因素对核酸的机械剪切； 防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pH值范围（pH值5-9），并要保持一定离子强度； 防止核酸的生物降解； 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。 2. DNA限制性内切酶酶切分析 基因工程 pUC18的酶切图谱 DNA的限制性内切酶酶 一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶； 来源于原核生物，功能类似高等动物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭； 水解核酸链中的磷酸二酯键； 限制性内切酶 酶分子 识别位点 切割位点 限制作用是否需用 ATP Ⅰ类 三亚基双功能酶 二分非对称 至少在识别位点外 1000bp Yes Ⅱ类 内切酶与甲基化酶分子不在一起 4-6bp, 大多数为回文对称结构 在识别位点中或靠近识别位点无特异性 No Ⅲ类 二亚基双功能酶 5-7 bp 非对称 在识别位点下游 24-26bp Yes 限制性内切酶可分为三类 Ⅱ类限制性内切酶 Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG-3’)； 有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。  5…G↓AATTC…3 →5… G AATTC…3 3…CTTAA↑G …5 →3… CTTAA G…5 限制性核酸内切酶的命名法 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称。 用一个字母代表菌株或型； 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示， 例子——HindⅢ：流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，第三个发现的酶称为。 实验注意事项 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 许多实验制备的DNA不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影响。 电泳检测示例 实验步骤 10*NE Buffer 2uL 质粒DNA 2uL XbaI 0.5uL Sal I 0.5uL H2O 13uL 10*BSA 2uL Total 20uL 1. 混匀试剂： 2. 37度水浴2小时； 3. 1%琼脂糖凝胶电泳观察； 注：质粒浓度——酶切质粒：全长4.5kb，酶切后分别为