多西紫杉醇诱导人乳腺癌MCF7细胞凋亡及相关基因表达的影响论文.docVIP

　　多西紫杉醇诱导人乳腺癌MCF7细胞凋亡及相关基因表达的影响论文 俞乔，高佳希，何晓松， 周晓明，戴美红，俞军 【摘要】 目的 探讨多西紫杉醇(docetaxcel)诱导体外培养人乳腺癌MCF7细胞凋亡的作用及凋亡的分子机制。方法 通过MTT比色法分析多西紫杉醇对人乳腺癌MCF7细胞增殖的影响；应用光镜、电镜观察细胞形态学的改变；AnnexinV/PI双染流式细胞术检测肿瘤细胞周期动力学和凋亡诱导率的影响；免疫组化方法检测凋亡相关基因bax、bc12的表达变化。结果 多西紫杉醇可明显抑制人乳腺癌MCF7细胞的增殖，并可导致其形态学的改变；随着加药时间的增长，G2/M期细胞增多.freelg/支，0.9%无菌生理盐水配成所需浓度。 1.2 细胞株 人乳腺癌细胞MCF7由中科院上海细胞生物学研究所细胞库提供。用含10%的小牛血清（杭州四季青生物工程公司）的1640培养基 (美国GIBCO公司),37℃，5% CO2 培养箱中培养传代。 1.3 实验方法 1.3.1 多西紫杉醇对乳腺癌细胞株MCF7的增殖作用研究（四甲基偶氮唑盐MTT比色法） 取对数生长期细胞用0.02% EDTA消化制成2×104/100μl细胞悬液。接种于96孔板，100μl/孔，置37℃，5％ CO2培养箱孵育过夜。给予相应浓度多西紫杉醇，对照组加入相同体积的培养基。ELx800通用型酶标仪（美国BioTek公司）570nm处检测OD值。抑制率计算如下： 抑制率%=1-加药组细胞平均吸光值对照组细胞平均吸光值×100% 1.3.2 多西紫杉醇对MCF7细胞形态学及超微结构的影响 细胞经0.02% EDTA消化后，制成细胞悬液1×106/ml，贴壁后加多西紫杉醇1.2μM，作用48h后，光镜下观察（×40）。收集细胞，电镜观测。 1.3.3 多西紫杉醇对MCF7细胞凋亡率及细胞周期变化的影响 将处于对数生长期的细胞， 调成1×106/ml， 待细胞贴壁后， 加入多西紫杉醇1.2μM， 对照组不加药， 分别于24h、 48h、 72h收集细胞， 用碘化丙啶（PI）进行DNA染色， 用流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）进行DNA含量分析和细胞周期分析， 分析软件为MODFIT和CELLQUEST。 1.3.4 AnnexinV/PI双染流式细胞术检测多西紫杉醇对MCF7的诱导凋亡作用 加药24h、 48h后收集细胞， 依Annexin VFITC Kit（bender公司）操作， 取出195μl细胞悬液加入5μl Annexin VFITC混匀并且室温放置10min。 用PBS清洗细胞并重新悬浮于190μl以配好的结合缓冲液中。 加10μl的20μg/ml的PI， 流式细胞仪检测早期细胞凋亡情况。 1.3.5 免疫组化检测多西紫杉醇对MCF7细胞bax、 bc12基因蛋白表达的影响 将1×106细胞接种于25ml细胞培养瓶中， 待细胞完全贴壁后,加多西紫杉醇1.2μM， 作用48h后， 收集细胞， 涂片， 4℃纯丙酮固定， 然后分别加入抗bax、bc12抗体， 室温下孵育60min或4℃过夜； 生物素标记的二抗， 37℃孵育60min， DBA溶液显色后， 苏木素复染， 中性树胶封固， 镜检。 阳性判断： bax、bc12基因产物以胞浆和/或胞膜着咖啡色为阳性细胞。 2 结果 2.1 多西紫杉醇对MCF7细胞生长的抑制作用 采用MTT法，研究多西紫杉醇对体外培养人乳腺癌MCF7细胞的生长抑制作用，绘制其生长抑制曲线，经线性回归得到，药物作用48h，多西紫杉醇对MCF7细胞的IC50为1.20±0.20μM，表明多西紫杉醇对人乳腺癌细胞株MCF7有生长抑制作用，并呈现明显的量效关系，见图1。 2.2 多西紫杉醇对MCF7细胞形态学及超微结构的影响 光镜研究结果表明，人乳腺癌细胞MCF7经多西紫杉醇作用48h后，给药组出现明显改变，癌细胞变圆，坏死，生长缓慢。对照组细胞呈上皮性生长迅速，细胞轮廓清楚，见图2。电镜下观察到,对 图1 多西紫杉醇对MCF7细胞的抑制作用 照组：细胞核大,形状不规则,常染色,质丰富,核仁大而明显,见多个核仁。药物作用后,.freelurro F, Gonella R, et al. Dosedense vinorelbine and paclitaxel ulating factor in metastatic breast cancer patients: antitumor activity and peripheral blood progenitor cell mobilization capabilityJ. Breast Can