多重 PCR 检测耐万古霉素肠球菌的基因型研究论文.docVIP

　　多重 PCR 检测耐万古霉素肠球菌的基因型研究论文 【摘要】 目的：研究 7 株耐万古霉素肠球菌（VRE）耐药表型和基因型，指导临床合理使用抗生素。方法：采用琼脂筛选法筛选 VRE，并分别用 E test 、多重 PCR 和限制性长度多态性分析方法检测万古霉素耐药或中介肠球菌株的表型和基因型。结果：7 株对万古霉素耐药或中介的肠球菌株，2 株为 van A 型，3 株为 van C1 型，1 株为 van C 2/3 型，1 株基因型未明，基因型和表型一致。结论：7 株 VRE 中有 2 株 van A 型.freelediate enterococci ultiplex PCR-restriction fragment length polymorphism. Results 7 strains ediate to enterococci, vanA for 2 strains ed to the genotypes. Conclusion 2 strains vanA have found. It is important for clinical laboratory to detect VRE ethods to instruct rational application of antibiotics clinically and prevent VRE prevalence. 〔Key -H 琼脂、脑心浸液培养基购自 Oxoid 公司；Taq 酶及 dNTPs 等购自上海英俊公司；引物：van A，van B，van C1 和 van C23 由上英俊公司合成。引物序列 vanA：P1:5，-CATGACATATCGGTAAAATC-3，P2:5，-CATGACATATCGGTAAAATC-3，（885bp）；vanB：P1:5，-CATGATGTGTCGGTAAAATC -3，P2:5，-ACCGGGCAGRGTATTGAC-3，（885bp）；vanC1：P1:5，-GATGGCAGTATCCAAGGA -3，P2：5，-GTGATCGTGGCGCTG-3，（467bp）；vanC2/C3：P1:5，-GATGGCAGTATCCAAGGA-3，P2:5，-ATCGAAAAAGCCGTCTAC-3，（429bp）2。 1.4 主要实验仪器 VITEK-32 AMS 微生物鉴定系统，生物梅里埃公司；DNA 扩增仪，MJ公司；GeneGENIUS 全自动凝胶图像分析系统，SYNGENE 公司。 1.5 菌株鉴定 用 VITEK-32 AMS 微生物鉴定系统和 GPI 鉴定卡鉴定肠球菌。 1.6 药敏试验（纸片扩散法和 E test） 按美国临床实验室标准化委员会 2004 年版操作和判断结果。 1.7 细菌 DNA 提取 将细菌接种在普通营养琼脂（LB）液体培养基中，35℃过夜。取 1.5 mL 菌液倒入 eppendorf 管中，12 000 r/min 离心 5 min，去上清，用 80 L DNA 提取液将细菌重悬，混匀，100℃水浴 20 min 后，取出并迅速置于冰上，放置 10 min，10 000 rpm/min 离心 1 min，上清即为模板。 1.8 多重聚合酶链反应（PCR） 反应体积 50 L，含引物混合液 8 L〔取 vanA-FOR（10 pmol/ L），vanB-FOR（10 pmol/ L），vanC1-REV（10 pmol/ L），vanC23-REV（10 pmol/ L）各 20 L；vanAB-REV（10 pmol/ L），vanC123-FOR（10 pmol/ L）各 40 L 于 1.5 mL 离心管中充分混合〕，dNTPs 2 L，模板 3 L，Taq 酶 1.25 U。PCR 反应条件：94℃预变性 5 min，94℃ 45 s ，50℃ 45 s，72℃ 2 min 共 30 个循环，最后 1 个循环后 72℃延伸 7 min，扩增产物加入 1% 的琼脂糖凝胶，电泳后在全自动凝胶图像分析系统下照相观察。 1.9 限制性内切酶酶切 对阳性片段用 Msp I 酶切鉴定分型，酶切体系 20 L，其中 2 L 内切酶缓冲液、2 L BSA、1 L Msp I、5 L 无菌水和 10 L PCR 产物，将样本置于37℃水浴中酶切 1 h。产物加入 3% 的琼脂糖凝胶，电泳后在全自动凝胶图像分析系统下照相观察。 2 结 果 2.1 肠球菌耐万古霉素琼脂筛选结果 7 株VRE 均在含 6 L/mL 万古霉素的 BHI 筛选平板上生长，其中 1 株为粪肠球菌，2 株为屎肠球菌，3 株为鹑鸡肠球菌，1 株为铅黄肠球菌。 2.2 E test 结果 对 3