放射性配体受体结合试验概论.pdfVIP

放射性配体受体结合试验 1、定义: 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析（radioassay of receptors），它是应用放射性核素标记配基与特异受体相结合，研究 受体的亲和力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。 2、原理: 1）、放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细胞，或含有受体 的制剂一起温育，使受体和配基充分结合，形成受体-配基复合物， 终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定滤膜 或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基结合的受体的量。 2）、放射配基与受体制备物（含受体的组织或细胞制备物）作用时， 其结合形式有两种，一种是配基与受体的特异性结合，其特点是亲和 力高；且由于受体有限，故具有饱和性。另一种是配基与受体制备物 的非受体分子的结合，称为非特异性结合。其特点是亲和力低但结合 点多，不易饱和。用放射性配基研究特异性受体时，必须设法减除非 特异性结合。一般采用的方法是制备总结合管和非特异结合管，两者 计数之差即为特异性结合量。 总结合管：将放射性配基与受体制备物反应，除去游离的放射性配基，测定结合 的放射性配基的计数，（其中包含特异性结合与非特异性结合，称为总结合）。 非特异性结合管：将大量（一般为500－1000 倍）非标记特异性配基与标记的放 射性配基相混，然后共同与受体制备物反应。由于非标记配基与标记配基两者比 例悬殊，所以受体几乎全部被非标记配基饱和，标记配基只能与组织制备物中的 非特异结合位点结合。这时测出的标记配基的结合量，反映的是非特异结合量。 用总结合管的计数减去非特异结合管的计数，即可得到特异结合计数。 3、分类： RBA 用放射性核素来标记配基，与相应的受体进行特异性结合反应， 可对受体的性质进行定性和定量的分析。 1、定性 RBA：是通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型，单 位点或多位点结合式，及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协 作性等。 2、定量 RBA：是在已知配体与受体反应性质的基础上，通过结合反 应，给出一定量的组织或细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结 合的平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。 4、实验材料: 动物组织 仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高速离心机、电热恒温水温箱、 -80℃冰箱、制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） 材料（ 2ml/6ml 分离管、10ul/200ul/1ml 枪头、微纤维滤纸等） 药品（放射性配基、各种非标计化合物等） 5、实验具体步骤： 1）、配制各种缓冲液及试剂 按处方配比配制各种缓冲液贮备液 配制各种非标记配体溶液 配制各种受试药物溶液 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、试管、EP 管等 试剂：无水乙醇、超纯水、Tris 、抗血酸、优降宁、HCl 、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2 、 DMSO 、甲苯、PPO 、POPOP、Methysergide 、Butaclamol 及5HT 等 2）、制备膜受体 分离出目标组织 加 10 倍体积Tris-HCl 溶液冰冷的缓冲液,用组织匀浆机匀浆3 次， 每次数秒钟，制成组织匀浆液 组织匀浆液用低温高超离心机离心 （12000 转/分）3 次，每次20 分钟弃上清液，沉淀（膜受体）放-80 度超低温冰箱保存备用。 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低温高超离心机 试剂：超纯水 3）、加样： 取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定浓度的 膜受体溶液。 取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度 按以下顺序及比例加入各种反应液。 （1）总结合管：100ul 膜受体 + 200ul 缓冲液 + 10 ul 放射性配体 （2）非特异管：100ul 膜受体 + 100ul 缓冲液 + 100ul 非标记配体 + 10 ul 放射性配体 （3）受试物管：100ul 膜受体 + 100ul 缓冲液 + 100ul 药物溶液 + 10 ul 放射性配体 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP 管等 试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液 4）、受体配体结合反应： 以上各管在加完放射性配体后，立即放入37 度的水浴锅中，孵育20 分钟。20 分钟后把各管放入冰中终止反应。 注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：恒温水浴锅，制冰机 试剂：无 5）、分离游离及结合的放射性配体 上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装置进行过滤，并用 5-10ml 冰冷的缓冲液冲洗滤膜2 次。滤膜放入85