志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析论文.docVIP

　　志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析论文 【摘要】 目的 对志贺菌敏感株与诱导耐多药株全菌蛋白进行蛋白质组学比较，寻找细菌耐多药相关蛋白。方法 采用4类抗生素的次抑菌浓度，对临床分离鉴定的志贺菌敏感株进行诱导耐多药试验；对志贺菌敏感株及诱导耐多药株全菌蛋白进行双向电泳；电泳图谱采用Image Master 2D Platinum软件分析；差异表达蛋白进行基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MOLDI TOF-TOF质谱）分析。结果 成功获得志贺菌诱导耐多药株，在志贺菌敏感株与耐多药株全菌蛋白质图谱中分别检测出（946±37）个和（1096±189）个蛋白质斑点；共发现48个差异表达的蛋白点，其中5个质谱鉴定为ABC转运蛋白、谷胺酰转肽酶、天冬氨酸氨甲酰基转移酶、翻译延长因子Tu、单链DNA结合蛋白；其中前3个蛋白中在耐多药株中表达量增强，后2个减弱。结论 5个耐多药相关蛋白中在细胞代谢中起重要作用的酶类表达量上调；ABC转运蛋白在志贺菌诱导耐多药机制中起重要作用。 【关键词】 志贺菌 近年来，随着抗生素的广泛使用甚至滥用，造成志贺菌频繁发生变异.freelmobiline pH gradient pH3～10,L=24cm ）；IPG缓冲液、IPG覆盖液、两性电解质pharmalyte(pH3～10)、3-［(3-胆酰胺丙基)-乙二胺］-1-丙磺酸(3-［(3-cholamidopropyl)- dimethylammonio］-1-propanesulfonate,CHAPS)(美国Amersham Pharmacia公司)。丙烯酰胺、尿素（urea）、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、蛋白酶抑制剂丙甲基磺酰氟（PMSF）、亮抑蛋白酶肽（leupeptin）(美国Sigma公司)。固相pH梯度等电聚焦仪IPGphor IEF System ,垂直板电泳仪、ImageScanner光密度扫描仪、图像分析系统（美国Amersham Pharmacia公司）。 12 方法 121 蛋白质双向电泳 （1）蛋白提取方法：采用超声兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法〔2〕,略作改进。（2）可溶性总蛋白定量：应用BradFord法〔3〕对提取的可溶性总蛋白进行定量；（3）第一相固相pH梯度等电聚焦:按文献〔4〕,程序分别为30V7h，60V7h，150V05h，300V1h，600V1h，8000V12h。（4）平衡：按文献〔3〕。（5）第二相垂直板SDS电泳：按文献〔3〕。（6）染色：银染按Amersham Bioscience的银染方案稍作改进〔4〕。考马斯亮蓝染色按Neuhoff等的方法进行〔5〕。（7）图像扫描分析：用Amersham Bioscience的扫描仪投射扫描，分辨率为300dpi。数字化图像文件运用Image Master 2D Platinum软件分析。图像分析过程包括蛋白质斑点的检测、量化、背景扣除、匹配。蛋白质斑点经自动检测后进行手工校对，匹配之前先选一块胶作为参考凝胶，其他凝胶都与之匹配。 122 质谱分析 （1）质谱样品制备：比较双向电泳图谱，找到差异蛋白，切下1mm×1mm×1mm，置于15ml的Eppendorf管中,按文献〔6〕方法处理样品。(2)质谱鉴定:样品按照1∶1的比例,与含有α-氰基-羟基苯丙烯酸的50%乙腈/01%甲酸的溶液混合。所有质谱在4700 型MALDI TOF-TOF蛋白质分析系统下获得。选择反射式阳离子捕获方式，质量精确度为50mg/L;MS光谱质量范围800～4000Da。 123 数据库检索 光谱在全球蛋白服务工作站（Global Protein Server IC)诱导耐多药结果 志贺菌出发菌的抑菌浓度（MIC）分别为头孢噻吩32mg/L，诺氟沙星05mg/L，庆大霉素2mg/L，磺胺甲基异恶唑512mg/L。将此出发菌在1/2MIC的LB培养基中传代，最终得到MIC≥4倍诱导前的耐多药菌株，分别是出发菌株的6，6，8，8倍。 22 蛋白质双向电泳图谱比较 (1)敏感株：相同实验条件及参数设置情况下,对志贺菌可溶性总蛋白重复3次进行双向电泳分离，发现3次双向电泳图谱非常相似，蛋白质上样量为100μg，pH3～10,24cm线性干胶条通过Image Master 2D Platinum分析软件对其进行点检测，获得(946±37)个蛋白质斑点(图1)。(2)诱导耐多药株：对志贺菌诱导耐多药株可溶性总蛋白重复3次进行双向电泳分离，获得3块凝胶的平均蛋白质点数为1096±189（图2）。经过背景消减后，将其中1块凝胶作为参考凝胶进行匹配，匹配点数为1078±26，其匹配率为9836％。 23 2种菌株蛋白质差