果蝇总RNA和总蛋白狄侥提取及分析.docVIP

果蝇总RNA和总蛋白的提取及分析 摘要：本次实验主要分为两大部分。第一部分是以果蝇成体为材料，通过Trizol试剂直接从果蝇细胞或组织中提取总RNA，然后进行反转录制备cDNA，最后通过琼脂糖凝胶电泳来测定总RNA和cDNA的纯度，进而来进行分析。第二部分仍以果蝇成体为材料（有的小组是果蝇幼体），提取果蝇总蛋白，通过SDS检测果蝇总蛋白表达，最后对果蝇的蛋白含量进行了分析。 关键字：RT-PCR；cDNA；琼脂糖凝胶电泳；SDS 1 材料及仪器 1.1 实验材料 黑腹果蝇成虫2-3d龄，约6只，雌雄均等。 果蝇是一种非常重要的模式生物，通常所指的是黑腹果蝇，学名：Drosophila melanogaster，在分类学上所属动物界，节肢动物门，昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。果蝇以其繁殖迅速、生长周期短、易于养殖、相对性状丰富、基因组较为简单等显著特点成为了遗传学、分子生物学、发育生物学等重要学科的主要实验动物之一，对果蝇基因组的测序分析也较为透彻，因此，本实验选用果蝇为实验材料，可以使数据更加具有代表性和说服力。 1.2 试剂及仪器 1.2.1 试剂 Trizol裂解液（50mg/ml），氯仿，异丙醇，75%乙醇，RNase free H2O，琼脂糖，TAE电泳缓冲液，DNA marker，dd H2O，10×PCR Buffer （含Mg2+），dNTP（10 mM each），引物：rp49F、rp49R；CG8189F、CG8189R， Taq DNA polymerase（2U/μl），TBS缓冲液（20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl, pH7.9），蛋白上样缓冲液，染色液，脱色液 1.2.2 器材 1.5ml离心管，匀浆棒，高速台式离心机，200μl及1ml微量移液器及吸头，天平，量筒，锥形瓶，微波炉，制胶板，电泳槽，电泳仪，凝胶成像仪，PCR仪，水平摇床等。 2 实验方法及步骤 2.1 果蝇总RNA的提取、反转录过程及RT-PCR 2.1.1 果蝇总RNA的提取 取果蝇成体于1.5ml离心管中，加1ml Trizol（50mg/ml）裂解液后，用匀浆棒匀浆，室温放置5min，使其充分裂解，之后，在4℃条件下12000g离心5min。转移上清至一新离心管中，加入氯仿（200μl氯仿/ml Trizol），振荡混匀，室温放置2min。在4℃条件下，12000g离心15min。取出离心管，小心转移上层水相至新离心管中。加入异丙醇（0.5ml异丙醇/ml Trizol），充分缓慢混匀，室温放置5min。在4℃条件下12000g，离心10min。取出离心管，弃上清，加入1ml 75%乙醇，悬起管底沉淀，继续在4℃条件下，7500g离心5min。取出离心管，弃上清，室温干燥RNA沉淀。加入50μl RNase free H2O溶解，备用。 2.1.2反转录过程 以RNA为模板，利用Promega公司提供反转录试剂盒合成了第一链cDNA； （1）取一只DEPC处理过的小EP离心管，向其中加入以下混合液，其体系如下： Total RNA 1 μl RNase-free H2O 4 μl Oligo-anchor R 1 μl （2）将混合液充分混匀并瞬时离心，置于70 ?C孵育10 min后，立马在冰上冷却2 min，再次瞬时离心使得混合液集于管底； （3）冰上继续向管中加入 : 5×Reaction Buffer 5μl Ribonuclease inhibitor（20 U/μL） 1.25 μl dNTP Mix（10mM） 1.25 μl M-MLV Reverse Transcriptase 1μl RNase-free H2O 10.5μl （4）将总反应液轻轻混匀瞬时离心，42 ?C孵育 60 min; （5）最终转录产物用ddH2O水稀释适当倍数后作为PCR模板使用。 2.1.3 RT-PCR 在PCR管中加入如下反应体系： dd H2O 19.5μl