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口腔微生物分子生物学 武汉大学口腔医学院 边 专 什么是遗传物质？ 蛋白质 20种氨基酸 DNA 四种碱基 生命的主要遗传物质 脱氧核糖核酸（DNA） DNA结构的推衍 Chargaff: T+C=A+G A=T G=C X线衍射： DNA在两条链组成，相互平行 核酸的组成 DNA RNA 脱氧核糖 核糖 腺嘌吟 胞嘧啶 腺嘌呤 胞嘧啶 鸟嘌呤 胸腺嘧啶 鸟嘌呤 尿嘧啶 双链 单链 DNA复制 半保留复制 DNA复制 半不连接复制 由于DNA多聚酶只能从5’ → 3’方向合成DNA，因而半保留复制不能完全解释。 DNA复制的特点 新合成的子代DNA与亲代DNA完全一样，保证了遗传的稳定性。 RNA 信使RNA（mRNA) 核蛋白体RNA（rRNA) 转运RNA（tRNA) RNA的生物合成——转录 以DNA为模板合与RNA 由RNA多聚酶合成 从DNA上特定起始序列（启动子）开始，至终止信号结束 蛋白质的生物合成——翻译 遗传密码 由3个连续的核苷酸组成 蛋白质的生物合成——翻译 蛋白质合成过程 Ⅰ.氨基酸活化 Ⅱ.蛋白质合成的起始 AUG→甲酰化甲硫氨酸（fMet) Ⅲ.蛋白质合成的终止 终止码UAA、UGA、UAG 蛋白质的生物合成——翻译 新生多肽的加工 Ⅰ. fMet水解 Ⅱ. 磷酸化、糖基化、甲基化修饰 Ⅲ. 信号肽 蛋白质向细胞外分泌 基因表达 基因表达的调节 机体的每一个细胞都有一套完全相同的基因 共同表达的基因 特异性表达的基因 基因表达的调节 共同表达的基因 维持细胞基本结构、功能 基因表达的调节 特异性表达的基因 红细胞产生血红蛋白 B淋巴细胞产生抗体 成牙本质细胞分泌牙本质蛋白 基因表达调控的原因动力 细胞内、细胞间，或细胞与外界环境间关系的变化。 基因表达调节的方式 启动子 强启动子与RNA多聚酶有较强的结合能力，转录水平较高；弱启动子则反之。 基因表达调节的方式 调节蛋白的作用 — 负向调节 — 正向调节 负向调节 乳糖操纵子学说 正向调节 原核生物基因表达的调节 主要在转录水平 真核基因生物调节 多层次 复杂性 分子克隆技术 限制性内切酶 特定的识别序列，4~6个碱基对 在识别序列内固定位置切割，5’ –端磷酸基因， 3’-端羟基基团 切割后形成粘性或平滑末端 DNA连接酶 催化DNA中相邻3’羟基和5’ 磷酸基团之间形成3’ ，5’ –磷酸二酯键。 质 粒 细胞内独立于染色体外的环状DNA，能自我复制 其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译系统得以表达 分子2000~50000bp 构建质粒的特点 Ori区：复制起点 Par区：保证质粒均匀分布于子细胞 多克隆区：人为构建，便于克隆操作 选择因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑选 接 合 在适当的条件下，雄性菌和雌性菌混合时形成配对的雄性-雌性菌，并有遗传物质的单向转移。 雄性菌：含F性因子，染色体外环状DNA 转 化 外源DNA能进入细胞内并通过整合至宿主DNA中或独立复制保存于宿主细胞内。 转 录 利用噬菌体为媒介，将供体DNA转移到受体菌内的现象，能在自然状态下发生。 分子克隆常用技术 DNA电泳 基因转移 核酸杂交 聚合酶链反应PCR DNA电泳 可分离不同分子量的DNA 核酸杂交 原理： 在一定条件下（温度、pH值等）DNA双股螺旋可解开并分离 在一定条件下，两股游离的互补的核苷酸可自行配对形成双股 Southern Blot 电泳、转移、杂交 确定分子量 斑点杂交 目标序列的存在 目标序列的量 聚合酶链反应PCR 与龋病相关微生物的定量检测方法 细菌形态 生化反应 免疫反应 分子生物学方法 ----分子探针杂交 ----RFLP ----PCR 抽提细菌染色体DNA(Igarashi et al.1996) ----细菌 ----唾液 PCR反应过程 第一次PCR反应 预变性: 94℃ 4min 变性: 94℃ 1min 退火: 51℃ 1min 30cycles 延伸 : 72℃ 2min 最后延伸: 72℃ 5min 第二次PCR反