蛋白质定性定量分析—培训课件.ppt

* * * * * * * * 免疫印迹技术的基本操作(例PKC) 1、细胞裂解物的制备 2、细胞裂解液蛋白含量测定 3、细胞裂解物SDS－PAGE电泳 4、蛋白质转膜 5、目的蛋白的检测 * * * * * * * * * * * * * * * * 蛋白质的含量测定 凯氏定氮法：1883年丹麦化学家Kjeldhl建立，经后人改良后形成的一种定量测定蛋白质最为精确、敏感的方法。 原理：蛋白质的含氮量为16％，只要测出样品中氮的含量，即可计算出蛋白质的含量 样品中蛋白质的含量＝N×6.25 * * 凯氏定氮的基本流程： 1、消化：生物样品与浓硫酸共煮，样品蛋白质被无机化，其中氮元素转变为硫酸铵。 Pr＋H2SO4 CO2＋H2O＋(NH4)2SO4 (NH4)2SO4+2NaOH NH4OH+H2SO4 NH4OH+HCl NH4Cl+H2O * * * * * * * * 凯氏法的评价： 优点： 缺点： 1、适用于一切形态的样品； 2、不用比色，对混浊不透明的样品也可进行分析； 3、结果的精、准度较高。 1、样品中含有非蛋白态氮时影响分析结果； 2、组成蛋白质的氨基酸可影响分析结果； 3、操作复杂，对操作者的要求高。 * * Lowry法 Lowry法原理：是在双缩脲法和Folin酚法的基础上建立的一种新的蛋白质定量方法。蛋白质在碱性条件下与铜离子反应生成紫红色络合物。然后再与Folin试剂反应生物深蓝色。颜色与蛋白质含量成正比，符合朗伯－比尔定律。 * * 方法评价 优点 1、可对多个样品同时进行分析，操作简便； 2、结合Folin酚法，提高了分析的灵敏度； 3、结合双缩脲法，避免了Folin酚法的局限。 缺点 1、比色测定，要求显色后溶液透明，且样品必需可溶； 2、酚方式剂在碱性溶液中稳定性差，显色后需尽快比色； 3、干扰反应的因素较多。 * * 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mg/ml A 0.8 0.6 0.4 0.2 * * * * 紫外吸收法 原理：蛋白质在紫外区有两个吸收峰，其一为280nm，由芳香氨基酸上共轭双键引起，芳香氨基酸在各种蛋白质的的含量差别不大，测蛋白质溶液在280nm处的吸收值可计算出样品中蛋白质的含量。蛋白质第二紫外吸收峰在240nm以下，215nm最大，此峰是肽键引起。可通过215nm与225nm的差值计算出蛋白质的含量。 * * 考马斯亮蓝G-250染色法 原理：考马斯亮蓝在一定浓度的乙醇和酸性溶液中呈现红色，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收峰从465nm移到596nm。 优点： （1）操作简便；（2）敏感度较高（3）颜色稳定（4）对干扰剂不敏感。 缺点： （1）染料与蛋白质的实际状况复杂，色素与样品中的蛋白质不一定以当量相结合；（2）要求样品完全溶解；（3）样品不能回收使用。 * * 蛋白质相对分子量的测定 SDS－PAGE法测蛋白质的相对分子量：带电颗粒在电场中的迁移主要受三个因素的作用，即场强、颗粒本身的电荷及分子形状。因此一般电泳无法直接测定蛋白质的分子量。加入变性剂SDS后，蛋白质变性肽链伸展且蛋白质所带电荷被SDS的负电荷覆盖，在相同的电场下，蛋白质的迁移率只与蛋白质的分子量相关。 * * lgMr=lgK-bm=K1-bm * * SDS法测定分子量的操作： 1、标准蛋白质样品的制备：按商品说明书使用。 2、待测样品的制备：取待测蛋白质样品0.5mg，加入0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)1ml溶解。与标准蛋白质一起加入等体积的样品缓冲液，混匀，沸水浴加热3分钟后上样。 3、电泳分离及染色： * * 4、计算相对迁移率： Rf= 蛋白样品移动距离(cm) 指示染料移动距离(cm) * * * * * * 凝胶过滤测蛋白质分子量：测定大分子的分子量是凝胶过滤的应用之一。将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析，由于加入凝胶柱的物质分子质量不同，洗脱体积也不同。可根据洗脱体积求出柱的分配常数Kav，而Kav与蛋白质分子质量之间又存在线性关系，利用这一关系可绘制出Kav与分子质量的标准曲线。 * * * * Ve＝K1－K2logMr * * * * * * 方法的局限性： 1、在pH6～8的范围内，直线关系比较好，在极端pH时因蛋白质变性而引起偏离； 2、分子量与分配系数Kav有关，当蛋白质的轴比较大时，会引起测定偏离； 3、糖蛋白的含糖量大于5％时，测得的分子量比真实分子量大。 * * * *