动物细胞工程制药摘要.pptVIP

第 三 章动物细胞制药 第一节 概 述 细胞学说的建立 组织培养和细胞培养 细胞工程学 第二节 动物细胞的形态和生理特点 一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异。 离体培养细胞分两类： 贴壁细胞 悬浮细胞 ⒈贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。 两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞型 ⒉悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。 ⒊兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。 二、动物细胞的化学组成和代谢 1.动物细胞的化学组成 2.动物细胞的代谢 三、动物细胞的生理特点 ⒈ 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为12～48h， 细胞的分裂 周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2） 分裂期（M） G1期：4～6h 合成DNA聚合酶 RNA合成 S期：6～8h DNA合成 G2期：2～5h DNA量加倍, RNA合成 M期：0.5～1h 染色体分裂 细胞代数为细胞分裂次数 传代数表示细胞培养分种传代次数 细胞代数=传代数×分种数/2 X=(logN-logNo)÷log2 X 代数 N 培养最终细胞数 No 培养起始细胞数 倍增时间=培养经过时间÷代数 ⒉细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。 ⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。 原代培养 有限细胞系 无限细胞系 ⒋动物细胞对周围环境十分敏感. 各种理化因素：渗透压、pH、离子浓度、剪切 力、微量元素等。 　⒍动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。 动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体：合成蛋白质用于细胞质基质内。 粗面内质网的核糖体：合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。 动物细胞生产药物 缺点:培养条件高、成本贵、产量低。 优点:分泌胞外、纯化方便、翻译 后修饰糖基化，与天然产品一致。 第三节 生产用动物细胞的要求和获得 一、生产用动物细胞的要求 原代细胞 二倍体细胞系 转化细胞系 二、生产用动物细胞的获得 ⒈原代细胞 是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。 需要大量动物，费钱费劳力。 鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。 ⒉二倍体细胞系 　 原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。 二倍体细胞有正常细胞的特点： ①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。 ⒊转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化过程可以是自发的，和人工的，从肿瘤组织中。 4.融合细胞系 (1)仙台病毒融合法 (2)聚乙二醇融合法 (3)电融合法 5.重组工程细胞系 三、基因工程细胞构建和筛选 在生产中采用更多的更有前景的是融合细胞及采用基因工程构建的各种工程细胞。 ⒈真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类： ㈠病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒 ㈡质粒载体 ㈠病毒载体 其作为载体的 优点： ①双链DNA，易重组 ②插入7～8kb DNA不影响正常病毒粒子的形成。 ③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子； ④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%～30%； ⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性克隆。 ⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源基因。 质粒载体 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增，都含有如下基本成分： ①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。 ②含有使基因表达的调控元件。 ③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 ④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。 ⒉基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选 基因载体导动物细胞常用方法是： 磷酸钙沉淀法 电穿孔法 磷酸钙沉淀法： 溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导