双水相分配法.pptVIP

19 两水相分配法 19 双水相分配法 19.1 双水相的形成 19.2 相图 19.3 分配理论 19.4 影响分配的参数 19.5 应用 19.6 亲和分配 19.7 两水相生物转化反应 双水相分配法 有机溶剂萃取的不足： 许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂 ； 蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。 溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。 19.1 两水相的形成 亲水性的聚合物溶液 当两种聚合物溶液互相混合时，究竟是否分层或混合成一相，决定于两种因素：一为熵的增加，另一为分子间作用力。 熵增—混合—自发 分子间作用力---随着Mr的增加,而增大. 聚合物的不相容性---含有聚合物分子的溶液发生分相的现象. 主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的水相，所以具有强烈的相分离倾向。 某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓度达到一定值，也会形成两相，即聚合物—盐双水相体系 两水相系统 ① 系统含水量多达75%～90% ,两相界面张力极低,有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递 ② 分相时间短(特别是聚合物/ 盐系统) ,自然分相时间一般只有5～15min。 ③ 双水相萃取技术易于连续化操作。 ④ 目标产物的分配系数一般大于3,大多数情况下,目标产物有较高的收率。 ⑤ 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液分离方法相比,双水相萃取技术可省去1～2 个分离步骤,使整个分离过程更经济。 ⑥ 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。 19.2 相图 双节线(bi-nodal)：图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区，即ATPS 。 系线(tie line)： 双节线上两点的直线。 系线反映的信息 A 杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则 B 性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小. C临界点(critical point)：当系线长度趋于零时, 两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如K点。 19.3 物质在两相中的分配 和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。 K= C1/C2 C1、C2——分别代表上相、下相中溶质的浓度 K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。 1）表面能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大) 2）电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大) 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验） 19.3.1 表面自由能的影响 19.3.2 电荷的影响 道南电位(??, Donnan potential):实际双水相系统中有电解质, 当这些离子在两相中K? 1, 则两相间产生电位差?? 19.4 影响分配的参数 影响分配的主要参数有聚合物的分子量和浓度、pH、盐的种类和浓度、温度等。 适当选择各参数即在最适条件下，可达到较高的分配系数和选择性。 两水相分配法的一个重要优点是可直接从细胞破碎匀浆液中萃取蛋白质而无需将细胞碎片分离，因而在一步操作可达到固液分离和纯化两个目的。 改变pH和电解质浓度可进行反萃取。 19.4.1 成相聚合物的相对分子质量 当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的相。例如在PEG-Dx（Dx代表葡萄糖Dextran）系统中，PEG的分子量减小，会使分配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。这是一条普遍的规律，不论何种成相聚合物系统都适用。 溶质的分子量愈大，则影响程度也愈大 19.4.2 成相聚合物的浓度 当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数接近于1。 如成相聚合物的总浓度或聚合物／盐混合物的总浓度增加时，系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过1，或减小低于1。 必须指出，系线长度常是一个很重要的参数，用于表征系统的性质。 当远离临界点时，系统的表面张力也增加。如果进行分配的是细胞等固体颗粒，则细胞易集中在界面上，因为处在界面上时，使界面面积减小，从而使系统能量减小。但对溶解的蛋白质来说，这种现象比较少见。 19.4.3 盐类的影响 盐离子在两相中有不同的分配，因而在两相间形成电位差，由于各相要保持电中性，因此对于带电荷的蛋白质等物质的萃取来说,盐的存在就会使系统的电荷状态改变,从而对分配产生显著影响。