实验六 酵母醇脱氢酶的提取与纯化.ppt

3.逐管加入0.5 mL已稀释的酶液，混匀后立即测定A340，每隔15S读数一次，直到A340不变，记下反应时间和读数。 4.于另一比色皿中，以蒸馏水代替底物，做空白试验。 5.每分钟A340增加0.001为1个活力单位。 试剂配制 3.0mol/L 乙醇：174.6mL无水乙醇 0.06mol/L 焦磷酸钠（pH 8.5）：22.56g 焦磷酸钠 0.0015mol/L NAD+：0.995g NAD + 0.01mol/L K2HPO4：1.74g K2HPO4 0.066mol/L Na2HPO4：9.37g Na2HPO4 上述试剂称量后，分别加蒸馏水定容到1000mL。 * * 酵母醇脱氢酶的提取和纯化 一、实验目的 掌握蛋白质提取纯化、浓度测定和酶活性测定的原理和方法。 二、实验原理 用热变性、有机溶剂沉淀等方法，从酵母中提取一定纯度的醇脱氢酶。 醇脱氢酶可催化醇和醛之间的氧化还原反应，辅酶是NAD+/NADH。 CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO + NADH + H+ 乙醇过量时，NAD+被还原成NADH的速度与酶活力成正比，NADH在340nm有较强吸收，可测定单位时间内NADH的生成量，确定酶活力。 醇脱氢酶 三、实验材料、试剂和器材 材料：酵母 试剂：3.0 mol/L 乙醇 、0.06 mol/L焦磷酸钠（pH 8.5）、0.0015 mol/L NAD+ 、0.01 mol/L K2HPO4、丙酮 （预冷）、0.066 mol/L Na2HPO4 仪器：离心机、紫外-可见光分光光度计、水浴锅、透析袋 四、实验步骤 （一）提取纯化酵母醇脱氢酶 1. 粗提 称酵母粉5.0g，置研钵中，加半勺石英沙和Na2HPO4溶液10 mL，用力研磨10分钟，转入50 mL离心管，用30 mL Na2HPO4溶液洗研钵，转到离心管中，摇匀，静置5分钟，5000rpm离心5 min，取上清液，量取体积V1 ，取2个1 ml分别于1.5 ml离心管中，4℃保存备用，剩余的上清待用。 2. 热变性去除杂蛋白 剩余的上清在55℃保温15 min，间歇搅拌，冰浴冷却，5000 rpm离心5 min，取上清，量体积V2 ，取2个1 ml分别于1.5 ml离心管中， 4℃保存备用，剩余上清置冰浴中。 3. 有机溶剂沉淀杂蛋白 将置于冰浴中上清，加上清体积一半的预冷丙酮，混匀， 4℃静置5 min ，5000 rpm，离心5 min，取上清，量体积V3，取2个1 ml分别于1.5 ml离心管中，4℃保存备用，剩余上清倒入已置于冰浴中的50 ml离心管。 4. 有机溶剂沉淀酶蛋白 在上清中按100 ml加55 ml丙酮的比例，加入预冷丙酮，混匀，静置5 min，4℃，5000 rpm离心5 min。弃上清，沉淀溶于5.0 ml 0.01mol/L K2HPO4中，体积为V4，取2个1 ml分别于1.5 ml离心管中，4℃保存备用。 （二）酶活力测定 1. 将前面保存的上清用0.01mol/L K2HPO4稀释 第一步的上清液稀释5倍 第二、三、四步的酶液各稀释10倍 2. 准备5只试管，编号1-5，加入以下四种试剂 3.0M 乙醇 0.1ml 0.06M 焦磷酸钠 0.5ml 0.0015M NAD+ 0.1ml 蒸馏水 2.2ml （三）蛋白质含量测定（Bradford法） 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，最大吸收波长在595nm，在0～100μg/ml，吸光度与蛋白质含量成正比。 蛋白质与G-250反应在2 min内达到平衡，且稳定，可检测微克级的蛋白质。 仪器和试剂 仪器和用具 可见分光光度计，1.0 mL加液器，200μL加液器；10 mL PA瓶。 试剂 （1）牛血清白蛋白100μg/mL（标准蛋白质） （2）考马斯亮蓝 100 mg G-250溶于50 mL 90%乙醇，加85%（W/V）磷酸100 mL，用水定容到1000 mL。 1. 蛋白质标准曲线的制作（ 0～100μg/ml ） 取6个PA瓶，配制0～100μg/ml 蛋白液各1.0 ml。加5.0 ml G-250试剂，混匀，放置2 min，在595 nm比色，绘制标准曲线。 0～100μg/ml 血清白蛋白液 管 号 1 2 3 4 5 6 100μg/ml蛋白(ml) 蒸馏水(ml) 蛋白质(mg) 0 1.0