WATERS液相色谱教程三四七最全.ppt

液相色谱教程 (三)液相色谱实验操作 Waters 中国有限公司培训中心 启动液相色谱仪器的流程 开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算机，启动色谱管理软件 准备流动相 过滤,脱气 色谱泵排气 用新配制的流动相灌注泵 启动液相色谱仪器的流程 用准备好的流动相平衡色谱系统 可在泵的控制面板上设定流速参数(15×5泵需在软件控制下操作) 系统大约需平衡0.5--1小时方能稳定工作 准备样品 用流动相溶样或重组样品 编制仪器方法,开始实验 液相色谱对流动相的要求 色谱柱对流动相的要求 过滤除去微粒 纯度的要求 超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水 有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)， 并与填料相匹配 缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内 缓冲液（盐）的浓度不要太高(≤100mM) 流动相对样品的溶解度 调整有机溶剂和水的比例 最好用流动相溶样 液相色谱对流动相的要求 液相色谱仪器对流动相的要求∶ 与检测器匹配 脱气 避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统） 溶剂的粘度 防止细菌的生长 流动相的脱气 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液量均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化 流动相脱气的方法 加热 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化 抽真空 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波振荡 简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1分钟左右即可) 通惰性气体（一般用氦气） 可保持在线连续脱气，多用于低压梯度 在线脱气机 （in-line degasser) 可保持连续脱气，多用于低压梯度 流动相的保存 有机溶剂流动相: 室温下密封,避光保存 缓冲盐流动相: 当日现配现用 低温下密封保存,一般不超过3天 防止微生物生长 有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相: 低温密封保存 防止有机相的挥发 选用适宜的容器 保存于聚乙烯瓶中的超纯水 保存于棕色玻璃瓶中的超纯水 色谱泵的排气操作 色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排气： 将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动相中 打开泵及在线脱气机电源开关 将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路 设置流速到6-9ml/min,排液阀出口有液流连续流出 必要时(600泵)用10ml注射器从泵入口注入流动相 对于600,2695四元梯度泵,分别对所用各路溶剂进行排气操作 停止泵流速,关闭排液阀,恢复断开的管路,备用 注:泵排气后,应输液稳定(系统压力脉动小,一般在几十 Psi以内),否则,需重做排气操作 Waters 515 泵的前面板 电源开关 柱塞杆清洗孔 排液阀 Waters 2695 分离单元 色谱泵的运行 排气后的色谱泵即可用于实验运行 注意∶ 排气后，先设流速为 0 恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱 如需要，恢复排气时断开的控制线 根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值 若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡(包括排气操作) 色谱泵的维护保养 流动相要过滤 常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水冲洗柱塞杆清洗孔 关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互溶，要用一种中间溶剂过渡 色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中 液相色谱系统的清洗与钝化 色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染,应作清洗和钝化处理 一般采用30％磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化 清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢 钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜 色谱泵及系统的清洗 清洗液用30%磷酸水溶液 30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀 清洗步骤如下: 取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) 用30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)45分钟 (四元泵的A,B,C,D四路各为25%) 换成清水洗至出口水pH显中性 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用 色谱泵及系统的钝化 钝化液用6M硝酸水溶液 6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀 钝化步骤如下: 在清洗步骤完成后进行钝化处理 确认清洗用的磷酸已基本洗净 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) 用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/