不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳.pptVIP

蛋白质聚丙烯胺凝胶电泳 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（圆盘电泳） 电泳的概念 带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。 广泛应用于生物大分子的分离和鉴定 电泳的基本原理 利用物质的两个差异来分离物质 电泳分离蛋白质的原理 蛋白质两性解离与等电点 溶液pH与蛋白质PI决定蛋白质电荷性质与数量 不同蛋白质分子大小和分子形状的差异 实验室中常用到的电泳方法  （以介质分类） 纸电泳 醋酸纤维膜电泳 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳的影响因素 带电粒子的性质 电场强度 溶液的pH 聚丙烯酰胺凝胶 两单体构成的人工合成凝胶 丙烯酰胺（Acr） N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 作为电泳介质的优点 自由调节孔径；韧性好；性质稳定； 无电渗作用；无色透明。 合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法 化学合成系统 过硫酸铵（AP） 四甲基乙二胺（TEMED） 光学合成系统 核黄素 四甲基乙二胺（TEMED） 聚丙烯酰胺凝胶浓度与交联度 凝胶总浓度T=[(a+b)/m]×100% 交联剂百分比C=[b/(a+b)] ]×100% a为Acr克数，b为Bis克数， m为缓冲液体积（ml) a:b＜10 凝胶变脆、硬、呈乳白色 a:b＞100易断裂 （一般a:b=30左右，根据T可适当调整）） 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个不连续 凝胶孔径不同 缓冲液pH不同 缓冲液离子成分不同 聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 * * 电荷差异 电荷性质 电荷数量 分子差异 分子大小 分子形状 聚丙烯酰胺凝胶电泳 Gly - Pro - Cl- Gly - Pro - Cl- Cl- Cl- Cl- Pro - Pro - Pro - Gly - Gly - Gly - pH为8.3的电泳缓冲液（Tris-Gly） pH为6.7的浓缩胶 pH为8.9的分离胶 有效泳动率： MCl- M Gly- M Pro- Gly - Gly - Gly - Cl- Cl- Cl- Pro - Pro - Pro - 快离子Cl 慢离子Gly Gly pK1=3.24 pI＝6.0 pK2=9.7 － － 实验分组（每人做一管，每4人配一份胶） ?认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用） ? 封管 ? 分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，每组总体积为10ml，灌胶高度为7~8cm） 封正丁醇3mm（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握15min） 实验操作及注意事项 浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，每组总体积为4ml，灌胶高度为1.5cm,留1cm空加样） ? 倒掉正丁醇 灌浓缩胶 ? 封正丁醇3mm（观察界面，判断凝固时间） ? 安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡） 样品处理并加样（20ul）?加buffer?电泳（浓缩胶时3mA/管，分离胶时2mA/管，或8~15V/cm, 距底1cm时停止）剥 胶  固定（时间5min） 染色（时间2min） 漂洗脱色至背景透亮 实验结果的分析 相关理论 表-1 血清中各蛋白质的相关特性 种 类 分子量(万） PI 分 布(%) 清蛋白 ?1-球蛋白 ?2-球蛋白 ?-球蛋白 ?-球蛋白 6.9 5.0 9.0 13.0 11.0 6.1 7.3 6.8 7.6 8.0 55 2.1~30.8 4.1~72.5 1.2~25 15.6 前清蛋白 清蛋白 ?2-球蛋白 ?1-球蛋白 ?-球蛋白 ?-球蛋白