现代分子诊断解析.ppt

纯合突变体DNA C G G3’ 引物3 发绿光 A T G 3’ 引物3 无法扩增没有荧光 B ARMS检测突变体举例 杂合突变体DNA A G T 3’ 引物3 G 发黄光 C ARMS检测突变体举例 T C 引物1 引物2 G T 六、连接酶链反应 基本原理 利用DNA连接酶特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增 设计两对分别互补的引物，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，则LCR反应的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物 第五节 基因工程疫苗 一、疫苗的简介 二、基因工程疫苗 1、亚单位疫苗 2、肽基疫苗 3、DNA疫苗 一、疫苗的简介 Dr Edward Jener（1796）： 用一种奶牛痘感染人类，感染后不再被天花感染 Louis Pasteur （19世纪末）： 研制成功狂犬疫苗 Von Behring ＆Kitasato Shibasaburo： 开发研制白喉/破伤风疫苗 医学上最有潜力的防御物质 灭活的和减毒的致病物质 不能丧失引起免疫反应的能力 麻疹、白喉、百日咳、破伤风、天花、脊髓灰质炎 传统疫苗的局限性 ①有些致病物无法在培养基上生长； ②动物和人类的病毒需要在动物细胞中培养； ③培养的动物和人类病毒其生长速度和产量一般都很低； ④需要对实验室以及参加实验的操作人员采取特殊的保护措施； ⑤疫苗中的致病物质在疫苗生产过程中又可能没有完全杀死或充分减毒； ⑥减毒菌株有可能发生突变； ⑦有些疾病（如艾滋病）用传统的疫苗防治收效甚微； ⑧绝大多数的现行疫苗的有效期短。 衡量疫苗能否投入使用的标准 ——安全性 删除致病基因，保留抗原性。 ——有效性 尽可能调动机体细胞免疫和体液免疫。 免疫系统的工作机制：体液免疫、细胞免疫 抗原 抗原肽 细胞表面复合物 活化的B细胞（浆细胞） 淋巴因子 活化的T细胞 抗体 杀灭抗原分子 抗原显示细胞（如树状细胞） 吞噬，分解 MHC蛋白质 识别、激活 杀伤T细胞 激活释放 激活 分泌 体液免疫 细胞免疫 二、基因工程疫苗 指用基因工程的方法，表达出病原物的一段基因序列，将表达产物（多数是无毒性、无感染能力，但具有较强的免疫原性）用作疫苗 1、亚单位疫苗 利用病原物的某一部分制得的疫苗 明确编码具有免疫活性的特定抗原的DNA，一般选择病原体表面糖蛋白编码基因 对于易变异的病毒(如A型流感病毒)则可选择各亚型共有的核心蛋白的主要保护性抗原基因序列 应用重组DNA技术研制亚单位疫苗，还必须有合适的表达系统用来生产基因产物 优点： ①避免了直接使用病原物而使接受者可能致病的危险 ②亚单位疫苗利用纯化的蛋白质作为免疫源，可以避免由于外源蛋白、核酸的混杂等造成的种种副作用 ③有时单独使用特异蛋白能增加疫苗的效果 局限性： ①纯化单一的蛋白质十分昂贵 ②纯化后的蛋白质的构象与在体内可能不同，从而导致抗原性发生变化 ③亚单位疫苗一般不具有感染性 不能激活MHCI分子，也很难激活杀伤性T细胞，激活的免疫反应一般较弱 制备亚单位疫苗的基本前提是鉴定出病原物中哪些成分能激活机体产生抗体 2、肽疫苗 衣壳蛋白组成的外壳 病毒衣壳 病毒核酸 短肽 衔接物 只有位于病毒衣壳外表可以与抗体结合的蛋白质，其结构域才能引起免疫反应 类似于抗原决定簇的小肽充当疫苗 双肽：两个肽段连接形成一个较长的肽 不用载体蛋白保护，比其他任何一个肽段单独使用更加有效 与强免疫原性的载体蛋白－乙肝核心蛋白基因连接 限制因素： ①充当抗原抗原决定簇的肽段不能太长，而且要连续 ②要求肽段的构象必须与完整病毒上的抗原决定簇构象一致 ③要求选定的单一抗原决定簇必须要有足够强的免疫原性 三、DNA免疫 基因免疫、核酸免疫 Wolf （1993）将流感病毒核蛋白P抗原基因直接注射到小鼠骨骼肌引起免疫反应，产生多种亚型TK细胞。 目前已经进行的研究： 轮状病毒、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、狂犬病毒、结核杆菌亚单位疫苗等 “裸”DNA疫苗 不含肽、蛋白质或病毒载体，只是由来源于病原体的一个抗原编码基因及作为其载体的质粒DNA组成 这段抗原编