细胞与胚胎工程09动物染色体工程与性别控制.ppt

本章小结 本章小结 思 考 题 动物染色体工程与性别控制 第四节 动物性别控制 三、家畜性别控制的途径/(三)利用胚胎性别鉴定的性别控制法 4．分子生物学方法 (4)LAMP法 LAMP法是一种新式恒温核酸扩增方法(Notomi T 等，2000)，采用能特异识别靶序列上六个位点的四条引物及一种具有链置换活性的 DNA 聚合酶，在 65℃左右，不到一个小时的时间里进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到 109-1010个拷贝数量级。在扩增反应中产生茎环结构，保证引物与其杂交启动新一轮核酸合成，反应副产物焦磷酸镁沉淀可用肉眼观测到，以判断是否发生扩增。 该扩增法具有简便、快速、准确、廉价、易检测等特点。 Animal Cell and Embryo Biotechnology —— College of Veterinary Medicine——MA Bao-hua 动物染色体工程与性别控制 第四节 动物性别控制 三、家畜性别控制的途径/(三)利用胚胎性别鉴定的性别控制法 4．分子生物学方法 (4)LAMP法 LAMP 法具有许多迄今为止的其它扩增方法无法比拟的优点。①只需一恒定温度就能进行扩增反应。不需要特殊试剂，不需要预先进行双链 DNA 的变性。②高特异性。应用六个区段，四条引物，并且这六个区段的顺序也有规定。③快速、高效扩增。整个扩增在不到 1 小时即可完成。④灵敏度高 扩增模板可达 10拷贝亦或更少。⑤鉴定简便。 Animal Cell and Embryo Biotechnology —— College of Veterinary Medicine——MA Bao-hua 动物染色体工程与性别控制 第四节 动物性别控制 三、家畜性别控制的途径/(一)X、Y精子分离性别控制法 2．依据H-Y抗原和抗体免疫反应的精子分离法 (3)免疫磁力法 基本原理：首先用 H-Y单克隆抗体结合 Y精子上的 H-Y抗原，再加第二抗体包裹的超磁性多聚体小珠，振荡培养后，Y精子-单抗复合体即结合到二抗磁珠上，当用磁体对样品处理时，磁化了的磁珠(含Y精子)则粘附在试管壁上，上清液中的精子便是所需要的 X精子。 Animal Cell and Embryo Biotechnology —— College of Veterinary Medicine——MA Bao-hua 动物染色体工程与性别控制 第四节 动物性别控制 三、家畜性别控制的途径/(一)X、Y精子分离性别控制法 2．依据H-Y抗原和抗体免疫反应的精子分离法 (3)免疫磁力法 操作程序： ①精液处理(以牛为例) 细管冷冻精液在35℃水浴中解冻1 min, 以900g离心4 min。弃上清液，精子团在35℃、pH 7.1的磷酸盐缓冲液(PBS)中重新悬浮，以900g离心，重复3次，清洗结束后将精子小团在PBS中再悬浮，用血细胞计数器测定样品中精子浓度。 ②分离方法 第—抗体为对IgG的H-Y单克隆抗体(McAB 12/49)，第二抗体为山羊抗小鼠抗体。 Animal Cell and Embryo Biotechnology —— College of Veterinary Medicine——MA Bao-hua 动物染色体工程与性别控制 第四节 动物性别控制 三、家畜性别控制的途径/(一)X、Y精子分离性别控制法 2．依据H-Y抗原和抗体免疫反应的精子分离法 (3)免疫磁力法 将10 uL1:32稀释的McAB 12/49 添加到悬浮在250 uL PBS中的100个精子里，室温下培养20 min，在加第一抗体并培养到10 min时，轻轻混悬样品。培养结束后，向每个样品添加1 mL PBS，并以900g离心4 min。去上清液，精子小团在1 mL PBS中再悬浮，再以900g离心4 min。每—小团在250uL中悬浮，然后加入10 uL 1:8稀释的第二抗体，同时向每份样品中添加洗过的超磁化多聚体小殊(Dyna beads-M 450, Dynal INC)。按每个精子40粒珠子添加，即总量为40×106，随后将样品置振荡培养箱中培养20min。 Animal Cell and Embryo Biotechnology —— College of Veterinary Medicine——MA Bao-hua 动物染色体工程