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三、简答题 2．重组 DNA 的含义是什么? 答： 将一个生物的 DNA 片段插入到一个载体中，并引入到另一生物体中进行繁殖。 如何理解基因工程的两个特点? 答：基因工程的两个基本特点是分子水平的操作和细胞水平的表达。分子水平的操作包括 DNA 分离、切割和连接(还有其他一些 DNA 的修饰等)。由于体外重组 DNA 的 最终目的是要改变生物的遗传性，所以分子水平的操作和细胞水平的表达是基因工程的两个最基本的特点。 在 Cohen 构建有生物功能重组体的第一步实验中，用 EcoRI 切割了 R6-5 质粒，然后转化 E．coliC600，在卡那霉素抗性子板上筛选到了 pSCl02，它是由 R6-5 的三个 EcoRI 片段组成，请推测这个质粒具有什么遗传特性? 答：至少可说明两点：(1)pSC 102 含有复制起点，是一个独立的复制子；(2)重组 DNA 分子中的卡那霉素抗性基因得到了表达。 四、问答题 1． S．N Cohen 于 1973 年构建了三个重组体，pSCl02， pSCl05，pSCl09 请说明这三个重组体是如何获得的?各说明了什么? 答：pSCl02：用 EcoRI 切割 R6-5，混合转化大肠杆菌，在卡那霉素抗性平板上选择了一个克隆，并从该克隆中分离了重组质粒 DNA，命名为 pSCl02。该质粒是由质粒 R 6-5的 EcoRI 酶切片段Ⅲ、V 和Ⅷ在体内连接的，说明可以利用体内连接构建重组体。 pSCl05：作者分别用 EcoRI 切割质粒 pSC 101、pSC 102,然后加入 DNA 连接酶 进行连接后转化大肠杆菌，在四环素和卡那霉素双抗性的平板上筛选到 pSC 105。 说明用质粒作为载体，体外连接可得到有功能的重组体。 pSCl09：pSC 101 与 RSF 1010 的共整合，即用 EcoRl 分别切割这两个质粒，然 后在体外进行重组。说明两个独立的复制子体外重组后仍具有生物功能。 基因克隆是如何使含有单个基因的 DNA 片段得到纯化的? 答：大分子量的 DNA 会含有许多特殊限制性内切核酸酶的限制位点，因此用一种限制酶处理一完整染色体或整个基因组会产生许多不同的 DNA 片段，每一个片段带有基因组的一个不同的基因或一个不同的小片段。当全部片段与用同种限制酶处理过的载体分子混合时(图 A14.1)，每个片段将插入一个不同的载体分子(比如一个质粒)，同样地，当用这些质粒转化宿主细胞时，每个宿主细胞将只接收一个质粒 DNA 分子而筛选出的含重组质粒的每个菌落实际上会含有某一特异的供体 DNA 片段的多个拷贝。一旦带有待研究的特定基因的克隆被确认了，此重组 DNA 分子可从宿主细胞中提取出来进行纯化。 限制性内切核酸酶 四、简答题 2．说明 SangerDNA 测序法的原理。 答SangerDNA 测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由 5，端向 3，端聚合(DNA 聚合酶参与了细菌修复 DNA 合成过程)；(2)可 延伸的引物必须能提供游离的 3，羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的 3，羟 基末端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用 4 种双脱氧核苷酸终止反应， 则会获得 4 组长度不同的 DNA 片段。通过比较所有 DNA 片段的长度可以得知核 苷酸的序列。 3．在酶切反应缓冲液中加入 BSA 的目的是什么?机理是什么? 4． Fredrick 和 McClarin 等用一个由 13 个碱基对的 DNA 片段与 EcoRI、反应，然后分离到酶和 DNA 共结晶的复合物，通过 X 射线分析发现了什么? 5．有些噬菌体和质粒常常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统。你认为噬 菌体和质粒还有哪些可能的方式避免宿主的限制作用? 答：某些噬菌体的基因组中有修饰的碱基，因此对限制性内切核酸酶具有免疫作用。另一种避免限制酶切割的途径是抑制 SAMase 的活性，该酶制造 S—腺苷甲硫 氨酸。某些限制酶作用时需要 S—腺苷甲硫氨酸。然而，噬菌体在发育过程中 不能同某些单碳的供体反应。 6．某学生在用 EcoRI 切割外源 DNA 片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因? 7．在序列 5’—CGAACATATGGAGT-3’中含有一个 6bp 的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么? 8．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列：GAATCG， AAATTT， GATATC， ACGGCA?为什么? 9．用连接酶将