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　　枸杞RAPD反应体系的建立与优化论文 严奉坤，许兴，殷敏，杨亚亚，王娜 【摘要】 目的探索枸杞RAPD反应体系并对其进行优化。方法在本实验室常用的RAPD反应体系的基础上，根据RAPD扩增效果确定枸杞基因组DNA的最佳RAPD反应体系。结果建立了适合枸杞的RAPD反应体系：20μl体系中含1× PCR buffer，50 ng模板，0.4 μM 10碱基随机引物、1UTaq DNA聚合酶、2 mM Mg2+.freelent and Optimization of RAPD Reaction System in Lycium barbarum Abstract：ObjectiveTo study the RAPD reaction system in Lycium barbarum L. and optimization of it. MethodsBased on the RAPD reaction system suitable for Lycium barbarum L. plification containing 1× PCR buffer,50ng template DNA,0.4μm primer,1UTaq DNA polymerase,2 mmol/L Mg2+, 125 μmol/L dNTPs. ConclusionThe RAPD reaction system can be used to RAPD analysis in Lycium barbarum . Key barbarum； RAPD； Reaction system RAPD由 Peltier Thermal Cycler，M J Research，Inc，USA）；电泳仪（DYY-10C型；北京六一仪器厂）；电泳槽（DYCp-31型；北京六一仪器厂）；SmartSpecTM 3000核酸蛋白测定仪（BIO-RAD Lab，Inc，USA）；Eppendorf 5415D离心机；UVP GDS-8000凝胶成像系统。 Buffer、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、300bp DNA ladder购自北京天为时代公司， 10碱基随机引物购自上海生工生物工程有限公司，Agarose（Promega公司），EB（瑞士Fluka Chemika公司）。 1.3 方法 1.3.1 枸杞基因组DNA提取枸杞基因组DNA提取根据严奉坤等［3］的提取法进行。 1.3.2 PCR扩增及电泳检测反应在PTC-200型PCR仪上进行。初始扩增条件采用本实验室长期使用的20 μl反应体系，其成分为：10×Buffer（不含Mg2+）加0.8 μl 25 mmol/L Mg2+，1 μl 2.5 mmol/L dNTPs，1 UTaq DNA聚合酶，1 μl 0.375 μmol/L 10碱基随机引物，50 ng模板。反应程序：预变性94℃ 2 min；预扩增程序：94℃ 20 s，36℃ 30 s，72℃ 1 min，5个循环；扩增程序：94℃ 20 s，40℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环；然后72℃延伸10 min，最后4℃保存。扩增产物经含有0.5 μg/ml EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离（72v电压下电泳45 min），电泳结束后在UVP GDS-8000凝胶成像系统上观察照相。 2 结果 RAPD标记对PCR反应条件有较高的要求，因此在实验前需要建立严格稳定的反应体系，以确保准确、稳定地扩增。将模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、Mg2＋浓度、dNTPs浓度、退火温度和循环次数按单因素试验方案进行扩增实验，得到优化体系的结果。 2.1 DNA浓度在PCR反应体系体积为20 μl，引物浓度0.375 μmol/L、 Taq DNA聚合酶1 U、Mg2＋浓度1.0 mmol/L、dNTPs浓度125 μmol/L条件下，设定模板梯度0.5，1，2，20，200，500，1 000和2 000 ng/20 μl，以确定适宜的模板浓度。结果见图1所示。从图1看出：每反应中模板的终浓度小于1 ng/μl时无扩增；在模板终浓度为1～10 ng/μl的范围内有最佳的扩增, RAPD带的式样完全重复；而超出此浓度范围如在25 ng/μl时扩增式样改变并丢失大部分带，在50 ng/μl和100 ng/μl时扩增产物一片弥散。 2.2 引物浓度在PCR反应体系体积为20 μl，模板浓度50 ng/20 μl、Taq DNA聚合酶1 U、Mg2＋浓度1.0 mmol/L、dNTPs 浓度125 μmol/L条件下，设定随机引物浓度0.1，0.2，0.4和0.5 μmol/L，以确