第07章 酶和细胞固定化.ppt

固定化酶(enzyme immobilization):是指固定在一定的载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。 形式 ：酶柱—连续生产 反应器—批式搅拌反应 酶膜、酶管—分析化学 微胶囊酶—治疗酶 几点要求:（酶的固定化） 保持酶的催化活性和专一性 固定化酶可回收及多次使用 酶固定化后产生的位阻要小 固定化酶的成本尽可能低， 以利用于工业化生产使用 （1）物理吸附法 酶与载体之间的亲和力：范德华力、氢键、疏水作用 常用的载体：有机载体和无机载体 有机载体：纤维素、淀粉、骨胶原、火棉胶 无机载体：氧化铝、硅藻土、微孔玻璃 无机载体吸附容量低，一般在每克载体吸附1mg蛋白。 有机载体吸附容量高一些，火棉胶吸附木瓜蛋白，吸附容量每平方厘米膜70mg蛋白。 特点：载体来源广泛、操作简单、对酶的活性中心和高级结构影响少 。 （2）离子吸附法 酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶载体的固定方法。 常用的载体 阴离子交换剂：二乙基氨基乙基（DEAE）—纤维素、 DEAE—葡聚糖凝胶 阳离子交换剂：CM-纤维素、纤维素柠檬酸盐 离子吸附容量一般大于物理吸附容量，50-150mg蛋白/g载体 优点：方法简单，酶分子仅仅被包裹，未受到化学反应，酶活力回收力高。 缺点：只适合作用于小分子底物的酶，不适合作用于大分子底物的酶 根据载体材料和方法不同分为： 凝胶包埋法 半透膜包埋法 载体的要求 选择亲水性载体 载体结构松散、表面积大、一定的机械强度 载体要有在温和条件下与酶共价结合的功能基团 载体没有或少有非专一性吸附 载体来源容易、可反复使用 载体的选择 载体结构疏松、表面积大、机械强度 载体有与酶共价的功能基团 载体吸附功能有一定的专一性 载体来源广、价格廉价、重复使用 酶蛋白上可供载体结合的基团 酶蛋白N端氨基或赖氨酸的ε-氨基 酶蛋白C端的羧基以及天冬氨酸和谷氨酸的r-羧基 半胱氨酸的巯基 丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸-羟基 组氨酸-咪唑基 苯丙氨酸、酪氨酸—苯环 色氨酸的吲跺基 酶分子可以形成的共价键基团 氨基、羧基、巯基、咪唑基 常用的载体活化与偶联反应： 重氮反应、叠氮反应、溴化氮法、烷化法 常用的双功能试剂 举例：酶直接交联法—固定化酶 木瓜蛋白酶0.2℅酶蛋白浓度、2.3℅戊二醛、pH5.2~7.2、0℃交联24小时，可形成固定化酶。 随pH升高，固定化速度增加 pH低于4不能形成固定化酶 有人认为pH控制在酶的等电点附近有利于固定化 7.3 固定化酶的评价 1、固定化酶的活力测定 间歇测定 连续测定 2、固定化酶的比活 3、酶的固定化效率与酶的活力回收率 4、相对酶活力 5、固定化酶的操作半衰期 5、四种固定化酶制备方法的特点小结 物理吸附 包埋法 共价结合法 共价交联法 制备 易 易 难 难 结合力 弱 强 强 强 酶活力