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分生补充正负筛选法.doc
正负筛选法(positive and negtive selection)
正负筛选法的基本方法是:构建一种特殊的载体,该载体含有一段与靶基因同源的序列,在这段序列的某一外显子中插入Ncor基因作为正选择标记;在同循序列之外的3’末端,或3’,5’两个末端接上单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因的序列作为负筛选标记。经酶切后使其线性化,然后用电脉冲转染法导入细胞中,继续体外培养,并以药物G -418和GANC作双重筛选。如果所导入的重组 DNA与受体细胞基因组DNA之间发生非同源重组,则外源基因通常是从头至尾均整合入受体细胞基因组中,故其基因组中含有外源的基因(Neor, HSV-tk),此时的Neor和HSV-tk基因同时表达,其中Neor的基因产物使细胞具有G-418抗性,而HSV-tk基因的产物则将GANC磷酸化产生对细胞有毒性的物质,使细胞死亡。若为同源重组,外源目的基因及Neor基因会整合到受体细胞基因组同源序列的座位上,而位于同源序列外端的 HSV-tk基因则在重组后丢失,因而此时仅有 Neor表达,受体细胞同时具有G-418及GANC双重抗性而在选择培养基中存活下来。Mansour和 Capecchi采用此方法,已完成ES细胞 Hprt,int- 2,hox1.2,hox1.3等基因的定点突变。
基因敲除:
将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的方法。常用同源重组的方法敲除目的基因,观察生物或细胞的表型变化,是研究基因功能的重要手段。
条件性基因敲除
条件性基因打靶(conditional gene targeting),可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因打靶方法。以Cre-LoxP系统与基因打靶技术相结合的基因打靶技术。它实际上是在常规的基因打靶的基础上,利用Cre重组酶介导的位点特异性重组技术,在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”,从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。
条件性基因打靶特点
过条件性基因敲除,研究完全敲除具有致死效应的基因的功能以及基因在特定的组织细胞或个体发育特定阶段的功能。 ②通过条件性基因激活,实现转基因的可控制性表达。 ③通过Cre切除条件性基因修复(Cre excision-conditional gene repair),进行基因的可修复性敲除,以研究一个基因的多种功能。
诱导性基因打靶
它主要由Cre-LoxP及诱导系统组成。Cre-loxP系统由重组酶Cre和该酶的特定作用位点LoxP组成,其中的重组酶Cre可诱导LoxP所在的DNA发生缺失、插入、重复、倒位和易位等多种形式的基因突变或染色体畸变。诱导性基因打靶就是以该系统为基础、利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点,通过对诱导剂给予时间的控制、或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性、从而在LoxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因打靶技术。
根据所用诱导剂的种类,诱导性基因打靶可分为四环素诱导型、干扰素诱导型(二者所用诱导剂为控制Cre基因表达的启动子活性的活化物)和激素诱导型(所用诱导剂为Cre酶活性的激活物)等几种类型。而对由病毒或配体/DNA等载体介导的Cre定位表达系统来说,如果其Cre基因的表达或其目的产物Cre酶活性并不需要诱导剂的存在,那么严格说来它并不属于诱导性基因打靶的范畴。反之,则不失为一种不错的诱导性基因打靶策略,并且它因为不用建立Cre的表达或Cre的酶活性具有可诱导特性的转基因动物而可使成本降低。
总之,以Cre-LoxP系统介导的位点特异性重组为基础的诱导性基因打靶术的确有其优势: ①诱导基因突变的时间可人为控制; ②可避免因基因突变而致死胎的问题; ③在2个LoxP位点之间的重组率较高; ④如用病毒或配体/DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达,则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。 如果在Cre-ERT和Ad-Cre表达系统中采用组织细胞特异的启动子来控制Cre的表达,其诱导的基因重组的组织细胞特异性还可进一步提高。
基因诊断
基因诊断又称DNA诊断或分子诊断,通过分子生物学和分子遗传学的技术,直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常,从而对疾病做出判断。
原理:
核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。 基因诊断技术它的基本原理是:互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链,即能够进行杂交。这种结合是特异的,即严格按照碱基互补的原则进行,它不仅能在DNA和DNA之间进行,也能在DNA和RNA之间进行。因此,当用
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