第一节克隆载体教材.ppt

处于整合状态的噬菌体DNA称为原噬菌体 * * (1)缩短长度：野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型λ-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。 (2)删除重复的酶切位点：野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个；同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点；除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。 (3)加装选择标记：与质粒不同，野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容 λ-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记 (4)构建琥珀密码子的突变体：琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。 大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型λ-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种λ-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。 左侧区包括使噬菌体DNA成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约20kb 右侧区内包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长12kb。 中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体λ裂解生长的能力。置换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。 该类载体经改造后的长度为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为13.9kb（54.9-37kb）。由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（0-13.9kb） λgt10，可以携带8kb的DNA分子，插入位于cI基因内的单一的酶切位点EcoRI。插入失活导致裂解循环，从而很容易识别重组子。 λZAPII，含有多聚接头，可以使用六种不同的限制性内切酶插入约10kb的新的DNA分子，通过lacZ’基因的插入失活鉴定重组子，不能形成蓝色的噬菌斑。 该类载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或saλI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。显而易见，这类载体的容量不仅比插入型载体大，而且有一个下限：40-14kb=26kb包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。这类载体实际上已经不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去，当然这类载体的使用较为繁琐，现在商品化了的取代型载体已去除了中间片段 珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。 与质粒不同， CⅠ基因的功能是促使噬菌体进入溶源化，但在正常情况下，它的噬菌斑是不清楚 的，有点浑浊。这是因为在λ噬菌体感染时，有少数细胞进入溶源化途径，这些细 胞生长在噬菌斑中，就造成了噬菌斑浑浊。由于cⅠ基因的产物——阻遏物的失活， 不会有溶源菌的形成，因此，形成的噬菌斑都是清亮的，很容易将重组体与非重组体区 别开来。cI 阻遏物的名字就是指在该基因中插入一段DNA 后会使噬菌斑的形态变得清 亮(c=clear)。 λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了λ噬菌体的大肠杆菌中提 取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分： 一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当 这两部分包装蛋白与重组λ-DNA分子混合后，包装才能有效进 行，任何一种蛋白包装液被重组λ-DNA污染后，均不能被包装 成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的 λDNA的体外包装作用，在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体。 sup-不具有琥珀型突变体校正功能的菌株 在克隆载体基础上，为使插入的外源DNA片段有效转录翻译成多肽，装有强化外源基因表达的强启动子以及利于表达产物分泌、分离和纯化的元件，这种载体称为表达载体。 第一节 克隆载体 1.