实验十四 凝胶层析.ppt

实验十四 凝胶层析法测定细胞色素C的分子量 一、目的 1、了解凝胶过滤法测定蛋白质分子量的原理； 2、掌握运用该法测定生物大分子量的步骤； 3、懂得层析过程中的操作对分配系数确定的影响。 二、原理 ??? 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。把含有不同分子量的混合液，加在胶面上，让它流过凝胶柱。当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比筛孔小的分子，都能自由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入，介于二者之间的分子量则部分地进入筛孔。因此，在洗脱过程中，大分子物质在凝胶中的移动速度快，先从层析柱中流出，小分子物质后流出（见图十五 ），从而达到分离的目的。测定生物大分子的分子量是凝胶层析法的重要用途之一。用于分子量测定的凝胶有交联葡萄糖、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等。 4、上样与洗脱 ? ? (1）上样前先检查凝胶床面是否平整，如果倾斜不平整，可用玻棒将床面轻轻搅动，让凝胶自然下降，形成水平状态的胶面。用细长吸管小心吸去胶面上大部分溶液，然后让液面自然下降，直至几乎露出床面。 ? (2）用移液管吸取蓝色葡聚糖溶液0.15ml,细胞色素C 0.4ml置1ml的小离心管中，混匀后，用长吸管将样品沿柱子壁、非常小心地滴加到凝胶床面上，注意不要将床面凝胶冲起。加完后，再打开底端出口，使样品流至床表面。用少量洗脱液同样小心清洗表面1 次，然后将洗脱液在柱内约加至5㎝高。 ??(3）连接储液瓶、层析柱、部分收集器，让洗脱液恒压（30-50㎝水柱）洗脱，用部分收集器按每管3ml/7min收集洗脱液，各管于650nm(蓝色色溶液)、410nm（红色溶液）检测消光值（A）。 五、结果与分析 1、以管号（或洗脱液体积）为横坐标、相应分子量的对数为纵坐标，绘制洗脱曲线。 2、根据洗脱峰位置量出蓝色葡聚糖和细胞色素C的洗脱体积Vo和Ve，测量出凝胶柱的长度h和柱内径d，按柱体积公式计算Vt. Vt＝πχ(1/2d)2χh,然后根据Vt、Vo、Ve 。按分配系数求出细胞色素C的Kav值。 * * *