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（3）阳性克隆的分析与鉴定 从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能得到目的基因 序列测定、生物信息分析 功能预测、功能鉴定 2、T-DNA标签克隆基因 利用T-DNA插入突变 创造突变体，获取目 标基因或克隆 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 筛选T2，获突变子，应为3:1分离 确定T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代 克隆T-DNA两侧的植物DNA 利用侧翼DNA序列作探针从cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证（遗传互补测验，分离的 野生基因转化突变体，回复功能） 图12-11 T-DNA标签克隆基因的基本原理 3、基于PCR的基因克隆 原理：根据待扩增基因的序列合成引物，使两个引物序列之间的基因序列获得大量扩增，产生大量的基因拷贝用于研究 4、基因的人工合成 对于已知核苷酸序列、分子量较小的基因可以通过化学合成法制备基因。一般先一段一段地合成，然后将这些小片段连接起来。人工合成基因可以由DNA自动合成仪来完成 第三节 外源基因的导入 一、重组DNA技术 重组DNA：利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种 DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子 重组DNA技术主要步骤： 1) 从细胞或组织获得DNA并纯化 2) 用限制酶切割DNA 3) 将所得限制片段连接到载体上,形成重组DNA分子 4) 重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内复制， 产生大量相同拷贝的重组DNA分子--克隆 5) 克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化 6) 克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可以被分 离出来用于研究或商业开发。 重组DNA分子 二、植物遗传转化方法 1、农杆菌介导法 （1）根癌农杆菌(Ti质粒) （2）发根农杆菌(Ri质粒) 侵染后使植物细胞产生 许多毛状根(发状根) 图12-15 棉花转基因植株生产过程 F 1. 共培养 2. 在选择培养基上筛选 3. 筛选获得的抗性愈伤 5. 胚萌发成苗 6. 转基因植株移栽大田 4. 抗性愈伤分化成胚状体 2、基因枪法 基因枪法\生物弹法\微粒枪法\微粒轰击法—金、钨 依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术 优点：无宿主限制，可以对任何基因型材料进行转化研究 第四节 转基因生物的检测与鉴定 PCR Southern blot Northern blot Western blot 性状(表型)鉴定 PCR Southern blot Western blot Northern blot * 第十二章 基因工程 第一节 基因工程概述 遗传工程广义：细胞工程、染色体工程 细胞器工程、基因工程 酶工程、发酵工程 狭义：基因工程 基因工程概述 基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。 →1982年经美国食品及药物管理局批准 ，采用基因工程方法在细菌中表达生 产的人的胰岛素进入市场，成为基因 工程产品直接造福于人类的首例 →1985年转基因植物获得成功 →1996年克隆羊诞生。 →现在，人类已利用这一技术改造和创 建新的生命形态、生产药品、疫苗、 牛奶和食品，诊断和治疗遗传疾病。 基因工程的基本步骤： 1. 目的基因的分离或合成 2. 将目的基因与载体DNA连接，构建重 组DNA分子-表达载体 3. 将重组DNA分子导入受体细胞，并获 得具有外源基因的个体 4. 转基因生物的检测与鉴定 5. 转基因生物的安全性评价 第二节 基因的分离 基因分离（克隆）包括3个步骤： 1. 目标DNA片段（基因）的分离 2. 目标基因克隆到载体上 3. 载体导入宿主细胞并在其中 大量复制 一、工具酶 1、限制性内切核酸酶 限制酶：作用于特定（异）核苷酸序 列的磷酸二脂酶 Ⅰ型酶：仅EcoB和EcoK两种，催化限制 性切割和修饰核苷酸2种功能 Ⅱ型酶：基因工程中应用最广泛 Ⅲ型酶：具有特异的识别位点，识别位 点是非对称的 Ⅱ型限制性酶的基本特性： ① 有特异识别和切割的序列部位 ② DNA分子上两个单链断裂的部位通 常不是直接相对的 ③ 断裂所形成的DNA片段常具有碱基 互补的单链尾巴（粘性末端） ④ 内切酶的切割和修饰功能由两个 不同的酶催化所完成，即内切酶 活性和甲基化作用活性是分开的 限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接 回