大量提取质粒DNA(CsCl密度梯度离心法).PDFVIP

大量提取质粒 DNA （CsCl 密度梯度离心法） 李渊越 1. 预约摇床、超速离心机。 2. 配TB 培养基（1L 锥形瓶中装250 ml 培养液），并灭菌。质粒做好转化，并涂板。 3. 第一天早上，往TB 中加入适量的Amp 或Kana 。挑菌，37 ℃摇床培养 24 h ，至OD600 到10-15。 4. 检查以下药品：25 ％ sucrose in 50 mM Tris-HCl （pH8.0 ）250mL 、lysozyme 粉末1g 、0.5 M EDTA （pH8.0 ）50mL 、RNase A （100 mg/ml）150uL 、Triton-lysis100mL、PEG8000300mL 、1×TE150mL、 CsCl250g、正丁醇2 瓶、EB2mL 。 5. 第二天早上，把菌液倒入离心瓶中，用Beckman J6-MI 离心机以4,200 rpm, 20 min 离心。离心后，把 上清倒干。在离心的时候，配Lysozyme 25mL 。并将RNase 置于室温。 6. 弃上清，以20ml 25 ％ sucrose in 50 mM Tris-HCl （pH8.0 ），重悬至菌完全分散。 7. 加入4ml 新配制的lysozyme-EDTA-RNase 溶液。混匀，室温静置10 min 以上。 8. 在静置的同时，准备好高速离心管，往里面各加入5ml Triton-lysis 。 9. 将lysozyme-EDTA-RNase-DNA 溶液倒入高速离心管中，使用JA-30.50 Ti 转头，100,000g, 15min。 10. 将上清倒入新管中（不要把沉淀倒出来），加入PEG8000 使总体积至 50mL （1/2 体积），颠倒混匀， 于4 ℃中放置2 h 以上（过夜更好）。 11. 4,000 g 5 min ，去上清，加入8.5ml TE，溶解至无沉淀。 12. 加入11.00 g （要精确到小数点后2 位，便于配平）CsCl，溶解完全。 13. 在超离管中用200ul 枪加入 100ul EB （2mg/ml ），将溶液通过20mL 一次性注射器移入超离管中，用 TE 将液面补平至近管口。 14. 补加TE 至液面到超速离心管管口。 15. 称出每管重量，配平，封口。任选以下一种条件在20 ℃下进行密度梯度离心： 转头 转速 时间 Type 70.1 Ti 70,000rpm 20h NVT65 60,000rpm 16h NVT65 65,000rpm 8h 16. 灭250mL 以上的超纯水，并配好至少500mL 灭菌水饱和正丁醇。 #针头，抽取EB 带，（离心完可见两条EB 带，上面一条细浅 17. 超离后，取样品，用5 ml 注射器加上12 的带为断裂的质粒DNA,应抽取下面一条粗浓的EB 带）放入50ml 管中。 18. 以灭菌水饱和正丁醇溶液萃取EB ，直到溶液澄清无色。 19. 加入等体积TE （一定要加。若不加，在无水乙醇沉淀时，会沉淀下部分CsCl ）。 20. 加入2 倍体积预冷的无水乙醇，混匀（如果不充分混匀，可能会导致离下的DNA 是透明的，容易随 上清一起倒掉）。6,000rpm，20min ，（注意方向）去上清（注意沉淀不会贴壁，不要倒掉）。 21. 加入450 µl (~900ul)水，把50mL 离心管平放（注意方向），溶解，直到溶解完全（约需室温过夜）。 22. 用枪小心将液体吸入1.5mL 离心管中（如450ul ，可分成两管），加入十分之一体积的3 M NaAc (pH 5.2)，再加入2 倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于4C 或-20C 15-30min 。13,000 rpm 离心10min。 23. 用1mL 70%预冷的乙醇洗沉淀一次，13,000rpm 离心10min。 24. 去上清，以1mL TE 溶解完全，测定浓度。 大量提取质粒DNA （CsCl 密度梯度离