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P1噬菌体转导基因敲除操作步骤 实验室常用大肠杆菌基因敲除方法为P1噬菌体转导敲除。 大肠杆菌利用噬菌体为媒介，将供体细胞DNA转移给受体细胞，从而使受体细胞的基因型和表现型发生改变，这一过程称为转导。P1噬菌体的DNA分子量为5.8×107Da，在复制过程中，头部包装时容易发生错误包装，可将其宿主菌（供体菌）的基因组DNA误包入蛋白质衣壳内。当用这一噬菌体裂解液侵染新的宿主菌（受体菌）时，供体菌的DNA片段可随P1噬菌体进入受体菌内，并可以与受体菌基因进行同源重组，从而永久性的存在于受体菌基因组上。P1转导的频率一般很低，需要选择性标记进行转导子筛选，本实验中为卡那霉素抗性基因（KmR）。 准备材料 LB液体试管，LB半固体培养基，LB固体培养基， 20%（w/v）葡萄糖溶液，1M CaCl2溶液，1M MgSO4溶液，氯仿，1M柠檬酸三钠溶液； 效价109-1010（pfu/mL） P1噬菌体储液，大肠杆菌溶源???供体菌，大肠杆菌受体菌； TM buffer：10mM Tris-HCl（pH7.4）buffer加入10mM MgSO4； P1盐溶液：10mM CaCl2与5mM MgSO4的混合溶液； 实验步骤 平板培养法 准备野生菌种子液 自保存甘油管或划线培养平板上，转接到3mL LB液体试管中，37℃，250rpm，培养过夜（12hr）。 制备野生型P1噬菌体 将野生型菌株的过夜种子液，按1%（v/v）转接5mL LB液体试管，摇床培养至对数中期（~2*108细胞/mL，OD600=0.2~0.3）。 加入5mM CaCl2，继续培养至菌体细胞OD600=1。 取出野生菌培养液，低温聚菌，加入2倍体积的TM buffer重悬菌体。 倒下层平板，LB固体培养基中加入5mM CaCl2。 取2.5mL半固体LB培养基，加入0.25mL重悬菌液，混合均匀后倒在下层平板上，轻柔地倾斜平板使其均匀地覆盖在下层培养基表面。（注意培养基的温度不可过高，以手触摸时感觉温度舒适，建议先分别分装到15mM无菌离心管内，待凉到温度适宜后加入菌液，迅速混匀倒平板。） 待琼脂凝固后，点10ul P1噬菌体储液在上层细胞琼脂表面。待噬菌体储液被上层琼脂吸收后，将平板正置放置37℃培养过夜。对照板只有细胞，同样正置培养。（spot方法获得的噬菌体效价虽然高，但量太少，可能无法满足后续实验需求，可在步骤5中与上层细胞琼脂同时混合后倒平板，亦可获得高效价噬菌体） 计算效价，刮取噬菌体。 转导大肠杆菌供体菌（keio collection） 准备供体菌种子液，同野生型菌体。 接种100uL至5mL LB液体试管中，接种前在LB液体中加入0.1%（w/v）葡萄糖。需接种两支试管，一支做对照用。振荡培养约1.5hr，至菌体达到对数生长期（OD600=0.2~0.3）。 加入5mM CaCl2，并转移到大试管或小锥形瓶中。 加入50ul P1野生型噬菌体，混合均匀，37℃或室温静置20min。 加入7.5mL上层半固体培养基，混合均匀后倒在下层平板上。上层琼脂混合前需加入0.1%葡萄糖及2.5mM CaCl2。 37℃恒温培养箱内正置培养过夜。 固体法操作步骤较为繁琐，但制备所得的噬菌体效价非常高。 液体培养法 （野生型噬菌体及特定基因型噬菌体均可以用液体培养法制备） 准备3mL或5mL大肠杆菌供体菌（kieo collection）种子液，可同时准备受体菌种子液。 在5mL LB液体试管中加入0.2%（w/v）的葡萄糖及5mM CaCl2，并接种1% 过夜培养供体菌的种子液。 30℃或37℃振荡培养30~45min。（同样需OD600达到0.2~0.3） 加入100ul新制备的P1噬菌体（效价为109-1010（pfu/mL））。 继续培养，直至裂解。（需做对照，如果对照管即不加入噬菌体的试管正常生长，而加入噬菌体的试管裂解澄清，方为有效裂解） 加入一小滴氯仿（100ul），继续振荡几分钟。 转移上清至新的15mL无菌离心管中，9200*g，4℃，10min。 转移上清至新的15mL无菌离心管(预先加入100ul氯仿)或分装至1.5mL EP管中，标注基因型、制备人、日期等信息，4℃保存。 过夜培养受体菌，3mL或5mL均可。亦可第二天培养，但需培养较长时间。 次日，低速室温离心收集受体菌细胞，约需1.5mL培养液。 弃上清，加入1/2体积的无菌P1盐溶液重悬菌体。 分装菌体细胞，并加入不同体积的P1裂解液（基因型），对照管不加入P1裂解液。 P1 裂解液细胞A100ul1ulB100ul10ulC100ul100ulD100ul200ulE100ul300ulF100ul400ulG100ul