免疫荧光双染和细胞化学DAB染色步骤.docVIP

免疫荧光双染和细胞化学DAB染色步骤.doc

  1. 1、本文档共3页,可阅读全部内容。
  2. 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
  3. 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  4. 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
  5. 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
  6. 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们
  7. 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
  8. 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
免疫荧光双染和细胞化学DAB染色步骤

制备细胞爬片 1、在无菌培养皿或6孔细胞培养板中铺上灭菌后的盖玻片,在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液(细胞密度为2×105/ml)。再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖满盖玻片。将培养皿(6孔细胞培养板)置于 37℃,含 5% CO2及饱和湿度的CO2培养箱中培养。 2、4小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的底面。 3、倒置显微镜下观察,当细胞增殖到合适的密度后取出培养皿中止培养(一般为1-3天)。  4、倾去培养液,加 PBS(PH 7.2~7.4)洗涤细胞爬片 2 次,每次 1 min。 5、加 10%中性多聚甲醛(或-20℃预冷的丙酮)固定 10~15min。 6、吸除固定液,加 PBS 再洗涤细胞爬片 3 次,每次 5 min。 7、置于室温下干燥1小时,如暂不染色,先放在-20 冰箱中保存。 8、取出盖玻片时注意盖玻片的正反面(有细胞的为正面)。 将硅化玻片放入饭盒(金属),排好顺序,一定要放平,消毒,将消化好的细胞滴在硅化玻片上,可一片滴两滴,放入培养箱2小时,待细胞贴片,2小时后取出加培液至没过玻片,放培养箱过夜,取出后即丙酮固定,偶做过,效果不错的。10 mM磷酸钠缓冲液,pH7.5,150mM NaCl(PBS)中漂洗切片,3×5分钟。PBS液是用来漂洗和稀释的。其他缓冲液如Tris缓冲碱(TBS)也可用。 在细胞爬片上加0.03%-1% Triton X-100溶液处理15min。(若是要检测的抗原表达于胞膜,此步可考虑省略),PBS液洗3×5分钟 阻断步骤:用含5%的正常二度抗体物种来源血清的PBS孵化切片60分钟。(37℃) (一抗前不洗,只甩干) 原始抗体:在切片上吸干多余的阻断液,在室温下孵化60分钟或在4℃下相应地用稀释的两个物种(如鼠和兔)的未标记的一度抗体混合一起孵化过夜。当用荧光标记的原始抗体用于直接免疫染色(一度抗体)时,你可以跳过用二度抗体的间接免疫染色方法(二度抗体)的步骤(6)。(4℃过夜最好)在PBS液或TBS中漂洗3×5分钟。 二度抗体:用一对不同荧光素标记﹡﹡的二度抗体﹡,用以结合相应物种原始抗体的IgG,在室温下孵化切片60分钟,在PBS中漂洗3×5分钟。 复染:如果必要进行核染色如用DAPI(5μg/ml PBS中5min)。在PBS中漂洗切片3×5分钟。 选择性:为了阻止荧光标记从抗体上脱离,也为了更长的保存以保护染色,在水溶性媒介使用前,推荐在含4%甲醛的PBS液中简短的处理(1-3分钟)。在PBS中漂洗切片2×3分钟。 锚定:对于荧光显微镜,用抗褪色媒介锚定切片。 注释:﹡一般来说,两种二度抗体来自同一物种进行双/多标记 ﹡﹡当用生物素标记的二度抗体时,在进行复染色(步骤7)前,应首先用荧光标记的(链)亲和素的ABC技术(见6.2.1章节)来观察生物素。 细胞爬片的免疫化学染色法 (DAB染色) 1、在细胞爬片上加0.03% Triton X-100 水溶液处理15min。(若是要检测的抗原表达于胞膜,此步可考虑省略) 2、 吸除0.03% Triton X-100,加3%H2O2 孵育10min。 3、 吸除3%H2O2,加2%牛血清白蛋白封闭30~60min。PBS 洗5min。 4、 吸除PBS,分别滴加相应的一抗(用含1%牛血清白蛋白的PBS 液稀释到合适滴度),置于37℃孵育1h,或置于4℃冰箱中过夜。阴性对照片此步用PBS 替代一抗。 5、 吸去一抗,PBS 漂洗3 次,每次5min。滴加山羊抗鼠的IgG 抗体-fitc多聚体,37℃孵育30min。 6、 PBS 漂洗3 次,每次5min。新鲜配制DAB 显色液,滴加后作用3~5min,置于显微镜下观察染色结果。 7、 双蒸水漂洗后,滴加苏木精染液,染色10min。(1-2分钟就够了染得太浅要再染!) 8、 双蒸水漂洗后,滴加0.5%HCl-70%Ethanol(乙醇),作用1min 以分色。 9、 双蒸水漂洗后,滴加1%NaHCO3 作用3~5min 以蓝化细胞核。 10、双蒸水漂洗1min,然后将细胞爬片经70%、80%、95%、100%、100%乙醇 各1~2min 梯度脱水。 11、入二甲苯透明2 次,每次5min。(可以1-2分钟) 12、室温下晾干,用中性树胶封片。 13、显微镜下观察染色结果,并拍照。

文档评论(0)

xiaolan118 + 关注
实名认证
文档贡献者

你好,我好,大家好!

版权声明书
用户编号:7140162041000002

1亿VIP精品文档

相关文档