弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶激活因子基因的克隆、表达与功能鉴.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１）：３９～４３ 弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶激活因子基因的 克隆、表达与功能鉴定 １，２，３ ２ ２ ３ ２ ４ ４ 齐向辉 　梁　甜 　曹　博 　罗兆飞 　韦宇拓 　杨登峰 　黄日波 （１江苏大学食品与生物工程学院　镇江　２１２０１３　２广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室　南宁　５３０００５） （３石家庄融慧生物科技有限公司　石家庄　０５００００　４广西科学院　南宁　５３０００５） 摘要　１，３丙二醇是一种重要的化工原料，其生物法生产的研究逐渐受到的关注。研究以弗氏 ? 柠檬酸菌的总ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ分别扩增出约１．８ｋｂ（ｄｈａＦ）和０．４ｋｂ（ｄｈａＧ）的两个基因片 段分别编码甘油脱水酶激活因子大、小亚基，连接于ｐＭＤ１８Ｔ载体，测序分析显示与ＧｅｎＢａｎｋ中 ? 相关基因的相似性最高为８６％。将两基因以多顺反子的方式与ｐＳＥ３８０连接构建表达载体，并在 大肠杆菌中进行高效表达，表达量占总蛋白的３０％。将高效表达的激活因子用金属亲合层析和 分子筛进行了纯化，得到电泳纯级的甘油脱水酶激活因子，ＳＤＳＰＡＧＥ分析显示：大、小亚基分子 ? 量约为６３ｋＤａ和１２ｋＤａ；非变性胶分析显示：全酶的分子量约为１５０ｋＤａ，经扫描分析推测甘油脱 水酶激活因子很有可能是以αβ方式结合的。以弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶为研究对象，进行激 ２ ２ 活实验，结果证实该激活因子具备甘油脱水酶激活因子的功能，为进一步阐明甘油脱水酶的激活 机制及１，３丙二醇的高效生产奠定了基础。 ? 关键词　甘油脱水酶　激活因子　协同表达 结构 中图分类号　Ｑ８１４ 　　１，３丙二醇（１，３ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ，１，３ＰＤ）是一种重要 ＣｏＣ键发生不可逆断裂，形成５′脱氧腺苷和烷基钴胺 ? ? ? ? ? 的化工原料，在化工、医药等领域有着非常重要的应 素类似物，被修饰的辅酶和ＧＤＨｔ紧密结合，使酶失去 用。鉴于生物法制取 １，３ＰＤ具有化学合成技术不可 ? 活性，严重限制了甘油的转化，从而影响到１，３ＰＤ的 ? 比拟的优点，采用生物法制取 １，３ＰＤ的开发与研究在 ２＋ ２＋ ? 生产。在激活因子、ＡＴＰ、Ｍｎ 或Ｍｇ 存在下，被修饰 ［１］ 国际上越来越受到关注 。甘油脱水酶（ＧＤＨｔ，ＥＣ４． 的辅酶能够被完整的辅酶替代，使ＧＤＨｔ能够重新被激 ２．１．３０）是控制甘油转化为 １，３ＰＤ的关键酶和限速 ? 活具有活力，进行 １，３ＰＤ的代谢。因此，在生物法生 ? 酶，在弗氏柠檬酸菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ）、克雷伯氏菌 产中，为了稳定ＧＤＨｔ的活性，提高１，３ＰＤ的产量和生 ? （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、巴 氏 梭 菌 （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ 产效率，对ＧＤＨｔ激活因子进行研究具有重要的价值。