附录5菌种保存方法.pdfVIP

附录5 菌种保存方法 微生物具有容易变异的特性。因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最 不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素。所以，菌种保藏方 法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 一、保藏方法分类 1. 传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养 后于 4～6℃冰箱内保存。 2. 液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养 物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一 方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3. 载体保藏法 将微生物吸附在适当的载体如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏 法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4. 寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次体、螺旋体等， 它们必须在活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养 保藏法，病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5. 冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20～30℃，-50～-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮 （-196℃）等保藏法。 6. 冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除 去水分（真空）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备 细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子 键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、 甘油、二甲亚砜等。 97 二．各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1. 斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，将菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎 好，移至 2～8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存 2～4 个 月，移种 1 次。酵母菌 2 个月，细菌最好每月移种 1 次。 此法为实验室和工厂菌种室擦汗能够用的保藏法，优点是操作简单、使用方便， 不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染等。缺点是容易变异， 因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代后会使微生物的代谢改变， 而影响微生物的形状；污染杂菌的机会亦较多。 2. 液体石蜡保藏法 2 (1) 将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.05kgf/cm ， 121.3℃灭菌 30min，然后放在40 ℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。 (2) 将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，得到健壮的菌体或孢子。 (3) 用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜 面顶端 1cm 为准，使菌种与空气隔绝。 (4) 将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时 间还要长）。 此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏 2 年以上不死，酵母菌可保 藏 1～2 年，一般无芽孢细菌也可保藏 1 年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎 球菌，在 37℃温箱内，亦可保藏 3 个月之久。此法的优点是操作简单，不需特殊设备， 且不需经常移种。缺点是保藏时必须直立放置，所占位置较大，同时也不方便携带。 从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体 石蜡一起飞溅，应特别注意。 3. 滤纸保藏法 (1) 将滤纸剪成 0.5cm ×1.2cm 的小条，装入 0.6cm ×8cm 的安瓿管中，每管 1～2 2 ，121.3℃灭菌 30min 。 张，塞以棉塞，1.05kgf/cm (2) 将需要保存的菌种，在适宜的斜面培