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How to do ? Purification is a tough task Purification is a tough task 体外重组表达 Chapter I 小结 对蛋白质纯化过程大概了解 细胞破碎方法（重点） 沉降系数（理解掌握） 缓冲液 分子量 pKa值 缓冲范围 Tris 121.1 8.08 7.1-8.9 HEPES 238.3 7.47 7.2-8.2 MOPS 209.3 7.15 6.6-7.8 PIPES 304.3 6.76 6.2-7.3 MES 195.2 6.09 5.4-6.8 常用缓冲液的pKa值 Tris：三羟甲基氨基甲烷；HEPES：n-2-羟乙基哌嗪-n’-2-乙磷酸；MOPS：3-（n-吗啉代）丙磺酸；PIPES：n，n’-双（2-乙磺酸）哌嗪；MES：2-（n-吗啉代）乙磺酸。 Add some other components in case they are needed： 添加必要的稳定剂：巯基的保护剂(DTT, 巯基乙醇） 添加金属离子络合剂：EDTA 添加蛋白酶抑制剂： PMSF（苯甲基磺酰氟）〉抑制哺乳动物蛋白酶 DFP （磷酸二异丙基辅）〉抑制丝氨酸蛋白酶 蛋白质添加剂：BSA牛血清白蛋白或酪蛋白 纯化图表 3、酶活测定方法 Enzyme assays: Progress curve method （进度曲线法） Enzyme dilution curve Substrate dilution curve 4、pH对酶活力的影响 The effect of pH on enzyme activity： * * * 蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命，生物体结构越复杂，其蛋白质种类和功能越繁多，蛋白质的结构与功能有着密切关系，研究两者之间的关系，可从分子水平上去认识各种生命现象，为药物研制‘疾病的预防和治疗提供重要的理论依据。蛋白质纯化是这一切的基础！！！ 其主要的生物学功能是： 　　（一）催化和调节能力 　　某些蛋白质是酶，催化生物体内的物质代谢反应。某些蛋白质是激素，具有一定的调节功能，如胰岛素调节糖代谢、体内信号转导也常通过某些蛋白质介导。 　　（二）转运功能 　　某些蛋白具有运载功能，如血红蛋白是转运氧气和二氧化碳的工具，血清白蛋白可以运输自由脂肪酸及胆红素等。 　　(三）收缩或运动功能 　　某些蛋白质赋予细胞与器官收缩的能力，可以使其改变形状或运动。如骨骼肌收缩靠肌动蛋白和肌球蛋白。 　　(四) 防御功能 如免疫球蛋白，可抵抗外来的有害物质，保护机体。 　　(五）营养和储存功能如铁蛋白可以储存铁。 　　(六）结构蛋白 　　许多蛋白质起支持作用，给生物结构以强度及保护，如韧带含弹性蛋白，具有双向抗拉强度。 　　（七）其他功能 　　如病毒和噬菌体是核蛋白，病毒可以致病。 但一级结构中有些氨基酸的作用却是非常重要的，若蛋白质分子中起关键作用的氨基酸残基缺失或被替代，都会严重影响其空间构象或生理功能，产生某种疾病，这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。 血友病 胰島素是一种蛋白质激素，由胰脏内的胰島β細胞分泌。胰岛素参与调节糖代谢，控制血糖平衡，可用于治疗糖尿病 血友病是一种遗传性疾病。因为血液中缺乏凝血因子(Factor VIII 甲型 )，患者不仅极易出血，且一旦出血就无法自行止住，内腔器官出血往往会致命，患者只能靠注射凝血因子止血(Factor VIII). 血友病人是一批注定终身要依赖血液制品维持生命和健康的人群.血友病（Hemophilia）是一组由于血液中某些凝血因子的缺乏而导致患者产生严重凝血障碍的遗传性出血性疾病，男女均可发病，但绝大部分患者为男性。包括血友病A(甲）、血友病B（乙）和因子XI缺乏症（曾称血友病丙）。前两者为性连锁隐性遗传，后者为常染色体不完全隐性遗传。 原理葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使邻联甲苯胺生成蓝色物质，此有色物质在625nm波长下与葡萄糖浓度成正比。通过测定蓝色物质的吸光度值可计算样品中葡萄糖的含量。 * 生物大分子通常是指动植物和微生物在进行新陈代谢过程中所产生的蛋白质和核酸多糖等有机化合物的总称。 制备生物大分子的目的多种多样，如工业上、医药工业上，需要将某种具有特殊功能的生物大分子提纯到规定的纯度(即某一规格)。科研上，当研究生物大分子的性质、结构和生物功能的时候，常常将生物大分子提纯到要求的纯度。 以蛋白质和核酸的结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究生物大分子，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目