线粒体COI基因克隆详解.docVIP

线粒体COI基因的分子克隆 一、试剂材料 1、500一800克重的活鲤鱼和1500一2500克重的活草鱼 各五条 2、STE缓冲液(0.25mol/L蔗糖，10mmol/L Tris·HCI，1mmol/L EDTA，pH8.0) 1L 3、STM缓冲液(0.25mol/L蔗搪，10mM Tris·HCl，0.5mmol/L Mgcl2，PH8.0) 50mL 4、DNasel 2mg 5、0.5mol/L EDTA pH8.0 10mL 6、NTE缓冲液(20mmol/L NaCI，20mmol/L Tris·HCI，lmmol/L EDTA，pH8.0) 50mL 7、20% SDS 8、苯酚 50ml 9、3mol/L NaAC (pH 4.8) 5mL 10、冷乙醇(100%) 50mL 11、95%乙醇 200Ml 12、TE缓冲液(10mmol/LTrisHcl，1mmol/LEDTA，pH8·0)， 10mL 13、10mg/ml DNA一freeRNaseA溶液（溶解RNase A 于TE 缓冲液中，浓度为10mg/mL，煮沸10～30min, 除去DNase 活性，-20℃贮存溴化乙锭Nasel 25℃水浴中保温消化30分钟 8、取 0.8ml 0.5mol/L EDTA pH8.0 溶液加到消化液中，使终浓度为20mmol/L，终止酶解 反应。 9、然后再加入160ml STE缓冲液，20000g下离心20分钟，收集线粒体沉淀，重复用STE缓冲液漂洗线粒体二次，清除污染的核DNA 10、把离心所得的线粒体沉淀悬浮在20ml的NTE缓冲液，加入20% SDS溶液 至终浓度为0.8%，放置在37℃水浴中保温10分钟。 11、用等体积的苯酚抽提脱蛋白二次，留水相， 12、用10分之1的 3mol/L NaAC 和二倍体积的冷乙醇(100%)，混匀后放在一20℃冰箱中沉淀过夜。 13、离心收集mtDNA，真空干燥后溶于2.0ml的TE缓冲液, 加入40ul(10mg/ml)的DNA一free RNaseA溶液 置37℃水浴中保温60分钟。 14、消化液再用氯仿:苯酚:异戊醇 抽提2一3次。水相加乙醇沉.淀DNA，并将离心收集的mtDNA经真空干燥后，溶于适量的TE缓冲液中，贮于 —20℃冰箱备用。 线粒体CO I 基因的克隆 1． PCR扩增 （1）在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5μl dNTP mix（2mM ） 4μl 引物1（10pM） 2μl 引物2（10pM） 2μl Taq酶（2U/μl） 1μl DNA模板（50ng-1μg/μl） 1μl 加ddH2O至 50μl 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油（防止PCR过程中蒸发）。 （2）调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃变性40s→58℃退火30s→72℃延伸60s，循环30-35次，最后在72℃保温7~10min。 2、1%的琼脂糖凝胶电泳： （1）制胶（以60 mL为例） A、称取0.6 g琼脂糖，加入60 ml的TAE缓冲液（pH 8.0），摇匀； B、电炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶; 用东西盖上，防止挥发 ）； C、将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）加入2ul EB后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4～6 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30~ 45 min)； D、将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 （2）点样 (如在反应管中加有石蜡油，需用100μL氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测) 用移液枪将5 μl含溴酚蓝的扩增产物加入点样孔下部。 （3）电泳 打开电源开关，调节电压至3~5V/cm(约100V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40分钟后即可观察结果。 （4）观察 将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA（mark）进行电泳，则可通过性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。 大肠杆菌感受态细胞HB101的制备及转化 准备： 　　 一. 材料 E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Amp