酶快速反应动力学第五.pptVIP

第三章 酶反应的观察 在第二章，我们已经讨论了各种测量溶液中快速反应的技术。其中， Stopped-flow 和T-jump两种方法在观察酶反应方面已经获得了广泛的应 用。所观察的变化尤以吸收和荧光变化为最普遍。对那些含生色团，像 血红素(Heme), 核黄素(Flavin), 磷酸吡哆醛（Pyridoxal phosphate)等的 酶特别适合于这些技术的应用。我们可以把这些生色团视为观察酶反应 的天然探针。 然而，许多酶（如大多数水解酶）并不含这种天然探针，就要采用人 工探针或特殊装置。 对于可以观察光吸收或荧光变化的酶反应，根据观察对象的不同，可 以把这些酶分成三组： 1. 酶自身（它的必需生色团或蛋白部分）； 2. 配基（底物和底物类似物，NAD+ 型辅酶； 3. 指示剂或探针（不参与反应，但起到报告酶分子上发生变化的 作用）。 由于检测技术的发展，快速反应技术在研究各类酶反应已获得广泛 应用。本章通过讨论一些实例，介绍检测酶反应的技术。 第一节 酶自身光学性质的变化 这些变化可以分成三组： （1）必需原子团（包括辅基）的吸收或荧光光谱的变化； （2）酶蛋白的差吸收光谱； （3）酶蛋白质的荧光变化。 下面我们仅讨论（2）和 （3）两种情况。 一. 酶蛋白质的差吸收光谱 当配基与酶结合的瞬间或随后的过程，在260nm-310nm范围，可以 观察到由于酶蛋白Trp或Tyr微环境的变化所引起的差吸收光谱。一般来 说， 这种变化很小， ΔA/A（A为背景，即蛋白质本身的吸收）范围在 0.5-2%。这种较小的变化适合于Stopped-flow法的测量，而不适合于T- jump法的测量。 但在有些情况，在300nm附近，观察glucoamylase 和底物麦芽糊精 结合所引起的吸收变化。在这一波长，背景吸收较小， ΔA/A较大。在 300 nm附近的变化，只少可以部分地归于trp静电环境的变化。Fig. 3.1.1 是这种测量的例子。如果， ΔA/A值较大，也可以进行T-jump测量。 由T-jump法得到的该反应的弛预过程如Fig3.2.1所示. 二. 配基与酶非共价结合引起的配基光学性质的变化 某些核苷酸，如NAD+或NADH与酶结合时常常发生吸收或荧光光 谱的变化。甘油醛三磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase) 结合NAD+时，在360nm出现一条新带，叫Racker Band, 这对监测酶反应很有用。利用T-jump法已成功研究了该酶与NAD+ 的相互作用。然而，一般来说， NADH与酶的结合所引起的变化要比 NAD+与酶的结合容易观察。用NAD+取代酶结合的NADH的Stopped- Flow 时间曲线见Fig.3.2.2, 其中， NAD+是大过量的。 第三节 指示剂或探针的使用 如果反应不发生吸收变化或荧光变化，那么为了监测反应可以人为 地加入指示剂或探针。 一. pH 指示剂 伴有可解离基团pK值改变的反应，通常涉及质子的结合或释放。可以用pH 指示剂跟踪反应过程。反应体系微小的pH的变化就会引起pH指示剂吸收的变化。 pH指示剂法已广泛用于快速反应的测量，特别是T-Jump法。pH指示剂本身H+ 转移非常快，通常不到?Sec, 因此弛预时间大于10 ?Sec的反应，可用该法测量， 且安全可靠。 例如，T-jump法测量枯草杆菌蛋白酶BPN‘(Subtilisin BPN‘)结合苯硼酸（ Benzene Boronic Acid) 的反应，使用了对-硝基苯酚作pH指示剂。苯硼酸代表丝氨 酸蛋白酶一种可能的过度态类似物。结果如Fig.3.2.3。 反应引起的pH指示剂的吸收变化与反应引起的pH变化、指示剂浓度和 指示剂的pK值相关。 根据理论计算，选择pKa值接近测量条件下的pH值的指示剂比较好。 二. 酶结合的探针 把特殊的染料以共价或非共价形式连接到酶分子上，起到报告在反应 过程中酶分子发生变化的作用。 1. 可逆结合探针 活性部位探针（酶与配基的相互作用） 原黄素（Prolavine)和猩红（Biebrich scarlet)作为探针可以结合到酶 的活性部位。在吸收谱上可以看到所伴随的变化。 原黄素适合于标记Chymotrypsin 和Trypsin; 而猩红适合于标记 Lysozyme 和Chymotrypsin。