构建Gab1特异RNAi慢病毒载体及其对人血管内皮细胞增殖影响的分析.pdfVIP

SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 sec second 秒 SH2 Src homology domain2 Src 同源结构域 2 Src homology 2-containing tyrosine Shp2 酪氨酸磷酸激酶的一种 phosphates shRNA Short hairpin RNA 短发夹 RNA siRNA Small interfering RNA 小干扰 RNA 4 构建 Gab1 特异 RNAi 慢病毒载体及其对人血管内皮细胞增殖影响的研究 摘要 目的 构建针对人类生长因子受体结合蛋白 2 相关的接头蛋白 1 （Grb2-Associated Binder1，Gab1）基因的慢病毒干扰载体，从转录后水平抑制 Gab1 基因的表达， 并将构建的慢病毒 RNA 干扰载体载染人血管内皮细胞，研究沉默细胞内 Gab1 基 因表达后对细胞增殖能力的影响。 方法 针对人类 Gab1 基因设计 5 个靶点的 SiRNA 序列，并分别合成靶序列的 Oligo DNA，退火形成双链 DNA，与经 Hpa I 和 Xho I 限制性内切酶双酶切后的 GV118 载体连接，产生 Gab1-RNAi 重组质粒，PCR 筛选阳性克隆并进行测序鉴定。将各 个靶点的重组质粒与构建的 Gab1 过表达质粒共转染 293T 细胞，通过 Western-bolt 检测 Gab1 蛋白表达水平来筛迁最佳干扰靶点的重组质粒，再将最 佳的 Gab1-RNAi 重组质粒、pHelper1.0 和 pHelper2.0 质粒共转染 239T 细胞，包 装产生 LV-Gab1-RNAi 慢病毒并测定其滴度。并将获得的慢病毒分别载染 EA.hy926 细胞，通过荧光显微镜观察 GFP 的表达情况，测定其转染效率；通过 RT-PCR 和 Western-bolt 检测转染后的 EA.hy926 细胞中 Gab1 mRNA 和蛋白表达水平来验证 慢病毒干扰载体的基因沉默效率。将构建好的慢病毒干扰载体载染 EA.hy926 细 胞，在细胞接种后第 1、2、3、4 、5d 利用 MTT 分析方法检测其对细胞增殖的影 响。 结果 1、 筛选阳性克隆经ＰＣＲ及测序鉴定，成功将 Gab1 靶向含 shRNA 的双链 DNA 序列插入 GV118 载体中即 Gab1-RNAi 重组质粒构建成功。 9 2、包装产生的 LV-Gab1-RNAi 慢病毒载染 293T 细胞，测定的滴度为 3 ×10 TU/ml 。 3、RT-PCR 和 Western Blot 检测 RNAi 慢病毒载染后的血管内皮细胞中目的基因 表达水平，证实构建的慢病毒干扰载体可以高效抑制 Gab1 基因的表达。 4、沉默血管内皮细胞中Gab1 基因表达后，细胞增殖受到明显的抑制。 5 结论 构建的特异 RNAi 慢病毒能够高效载染血管内皮细胞，并且细胞内 Gab1 目的 基因 mRNA 和蛋白的表达水平显著降低，可为研究基因沉默前后血管内皮细胞生 物学行为的改变和探讨 Gab1 基因在血管新生中的作用提供有效技术手段；Gab1 基因在促进细胞增殖方面有重要作用。 [关键词] Gab1 RNA 干扰 慢病毒载体 基因载染 血管内皮细胞 细胞增殖