第一章 protocol 实验.pdfVIP

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2017-06-22 发布于北京
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第一章 protocol 实验.pdf

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一、提取RNA 一、提取RNA 一一、、提提取取RRNNAA 1、从液氮罐取出组织，放入盛有液氮保温瓶中 2、用杵击碎组织，取小块放入刺破盖子的EP管，放入液氮中。 3、将装有组织的EP管取出，组织倒入研磨器内，将其磨碎。 4、磨碎组织中加入350ul裂解液，放入冰槽中充分反应。 5、转移至EP管，离心12000g×3min 6、取上清液至DNA柱，离心10000g×30s 7、弃DNA柱，向流出液中加入350ul70%乙醇，转移至RNA柱，离心10000g×15s 8、弃流出液，加700ulRW1Buffer,离心10000g×15s 9、弃流出液，加500ulRPEBuffer, 离心10000g×15s 10、弃流出液，加500ul80%乙醇，离心10000g×2min 11、弃流出液，换新管，干燥空转，离心12000g×5min 12、弃流出液，换1.5mlEP管，加15ulRnasefreewater,离心12000g×1min 13、提取的RNA2ul加98ul的Rnasefreewater,配好后测定其浓度。二、cutting lysteDNA提取二、cutting lysteDNA提取二二、、ccuuttttiinngg llyysstteeDDNNAA提提取取将0.5cm小鼠尾巴放于1.5ml离心管中，在小鼠耳朵上做记号以辨认加500ulCutting-lysteBuffer 于每管加20ul新鲜事先准备的0.1ng/mlProteinasek(0.1ng/ml) 溶解于加入cutting-lysteBuffer后每管中 50-55°c 摇床，旋转过夜第二天取出EP管离心8min11000rpm 准备两个EP管，标明小鼠标号标记包括对比标号 1组加1ml100%coldEtoA 另一组加750ul70%coldEtoA 将离心后上清液移入100%EtoA管中倒置混匀DNA 将DNA黏液用移液管吸出加入70%EtoA摇晃，涡旋离心13000rpm5min 弃EtoA（真空）确保EtoA全部吸出不损失沉淀空气中干燥加150mlTEBuffer 摇床 1h37°C 涡旋使溶解保存于-20°c 以用于PCR 配方：Cutting-lysteBuffer500ml 终浓度 25ml1MTris-HclPH7.5 50MmTris PH7.5 50ml0.5MEPTA PH8 50MmEDTAPH8 10ml5MNacl 100Mm Nacl 2.5ml1M DTT 5Mm DTT 2501M Spermidiner 0.5Mm Spermidine 50ml 10%SDS 1% SDS 储液 TrisHCL 24.2g/200ml PH7.5 1M EDTA 29.2g/200ml PH8 0.5M Nacl 29.3g/100ml 5M DTT 1.54g/10ml 1M Spermidine 0.145g/ml 1M SDS 10g/100ml 10% 三、PCR技术三、PCR技术