植生生化实验解读北大吴光耀.pptVIP

2011年精英教案第五届全国中学生物竞赛培训 植生、生化实验解读课 北京大学生命科学学院 吴光耀 教授 1. 蛋白质测定 (1) 总N量测定 有机N(甘氨酸) + H2SO4 —→ 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (NH4) 2SO4 + 2NaOH —→ 2H2O + Na2SO4 + 2NH3 NH4HB4O7+ HCl + 5H2O —→ NH4Cl + 4H3BO3 用酸滴定氨 1. 蛋白质测定 (2) 双缩脲法 测两个以上的肽键 碱性环境双缩脲与Cu++生成紫红色化合物 540nm [(NH2) 2CO] 2 —→NH2-CO-NH-CO-NH2 +NH3 1. 蛋白质测定 (3) Folin-酚法 是改进的双缩脲法 640nm 同时测定了酪氨酸酚基。 1. 蛋白质测定 (4) 紫外法 280nm 比色 1. 蛋白质测定 (5) 考马斯亮蓝法 考马斯蓝G-250可与蛋白结合, 从红色染料转变成蓝色。 595nm 测定吸收值 2. 核酸测定 (1) RNA 测定—→地衣酚法 RNA + HCl —→糠醛(核糖转变) 糠醛 + 3,5-二羟基甲苯(地衣酚) —→鲜绿色 670nm比色 2. 核酸测定 (2) DNA 测定—→ 二苯胺法 DNA + 冰乙酸—→ 羟酮基戊醛(脱氧核糖转化) 羟酮基戊醛 + 二苯胺 —→蓝色 595nm 比色 2. 核酸测定 (3) 定磷法 有机磷 + 高氯酸 —→ 无机磷 无机磷 + 磷钼酸—→钼蓝 660nm 比色 2. 核酸测定 (4) 紫外法 260nm 比色 3. 质粒DNA提取和测定 (1) 扩增质粒 LB + 氨苄青霉素 (2) 细菌裂解 +碱 (质粒DNA出来, 染色体DNA变性) (3) 沉淀蛋白 +乙酸钾、酚-氯仿 (4) 纯化质粒DNA 水相质粒DNA用乙醇沉淀 + RNase 溶于Tris缓冲液中 (5) 260nm测定, 或电泳测定 4. DNA平板电泳 (1) 制胶 Tris-硼酸缓冲液(TBE) + 1%琼脂糖 (2) 加液 TBE液 (3) 加样 样品 + 花青素 (4) 电泳 滤光板看DNA移动过程 5. PCR (Polymerase chain reaction) ---- DNA扩增 (1) 模板、引物、dNTP、聚合酶、缓冲液、Mg++ (2) 过程: 模板双链分开 →结合引物 →新链合成 (3) 可用毛囊DNA Y染色体DNA, 设计引物,PCR, 男有女无. 6. 层析 (1) 分配层析 纸层析、液相层析 (2) 吸附层析 活性碳、氧化铝 (3) 交换层析 离子交换剂 (4) 凝胶层析 Sephadex Sepharose Superdex 7. 糖的测定 (1) 萘酚反应 糖 + 酸 —→ 糠醛 +萘酚—→紫环反应 (2) 蒽酮反应 糖 + 蒽酮+硫酸—→兰绿色 7. 糖的测定 (3) 间苯二酚反应 酮糖 + 酸 —→ 羟甲基糠醛 +间苯二酚 —→鲜红色 (4) 甲基间苯二酚反应 戊糖 + 酸 —→ 糠醛 +地衣酚 —→兰色沉淀 己糖 ----------------------------- 褐色沉淀 8. 还原糖测定(有自由醛基) (1) 费林反应 葡萄糖 + Cu(OH) 2+ NaOH 氧化亚酮 —→ 红黄色 9. 叶绿素性质 双羧酸的酯 —→酯溶性. 非极性溶剂(正己烷、石油醚) 荧光 +HCl —→去镁叶绿素—→ +乙酸铜—→铜代叶绿素 +NaOH —→皂化 10. 线粒体氧化磷酸化 磷氧比(P/O): 这一电子传递链过程中, 形成ATP的量与消耗氧分子之间的比为磷氧比 11. 希尔用离心机分离了菠菜叶绿体, 他在分离叶绿体中加入氧化态的氧化还原剂---2,6二氯靛酚(DCIP) 后照光, 发现DCIP被还原(氧化态兰色, 还原态无色),