体外PD-L1通路封闭实验步骤.pptxVIP

体外PD-1/PD-L1通路封闭实验步骤;1）每个样本留取5x106个PBMC，在T25的培养瓶中悬浮于3ml的完全培养基中； 2）每个培养瓶加入10μg Purified anti-PD-L1; 3）在37℃、5%CO2孵箱中孵育6天； 4）6天后将细胞转移至无菌的流式管中，用细胞计数板显微镜下观察细胞的状态，计活细胞的数目； 5）用R10调整细胞浓度至1x107/ml; 6）ICS检测阻断后细胞免疫功能特征。 ;1 ）在无菌的96孔板中，建立 ICS 实验（每份标本 3 孔），每孔包括包括以下试剂： PBMC: 1 x 107/ml in R10,100μl 1μl CD28-Pure (BD Pharmingen) 1μl CD49d-Pure (BD Pharmingen) Monensin ( Golgistop , 0.7ul/ml ; BD Biosciences ) FITC-CD 107a (10 μl/test;BD Biosciences) 同时建立阴性对照、阳性对照，以及实验组（HIV-1肽库） 阴性对照：无刺激原 阳性对照：Staphylococcus enterotoxin B ( SEB,1μg/ml,sigma-Aldrich) HIV-1肽库：Gag Nef Env Pol VVVRT 各2 μl ;2 ）在 37°C、5% CO2 孵箱中孵育1小时； 3 ）每孔细胞中加入 10 μl brefeldinA ( 10 μg/ml;sigma-Aldrich)，继续在 37℃、5% CO2孵箱中孵育 5 小时； 4 ）取出细胞，放入 4 °C 冰箱中过夜或直接继续下列步骤。 ;下列所有步骤均要求避光，因此孵育过程必须使用锡箔纸覆盖细胞。 1 ）将 96 孔板中的刺激后的 PBMC 转移到流式管中； 2 ）在细胞管中加入 PBS，约 2/3 管，离心 1500 rpm x 10 分钟； 3 ）将上清倒到废液缸，用纱布或吸水纸除去残留液； 4 ）加入表面抗体： Anti-CD3-ECD ( 5 μl) Anti-CD4-A PC-Cy7 (2.5 μl) Anti-CD8-PerCP-Cy5.5 (10 μl) Anti-PD-1-APC (10 μl);5）以锡箔纸覆盖细胞后，在4 ℃冰箱中孵育30分钟。 6）用PBS洗涤后，加入250 μl Fixation/perm ( BD Biosciences ) ，充分混匀后在4℃冰箱中孵育20分钟； 7) 1 x Perm/Washbuffe（BD Bioscienccs ）洗涤两次，每次加入 2 ml 的洗液。离心 1500 rpm x 10 分钟； 8）加入抗细胞因子抗体：anti-IFN-γ-PE-Cy7 mAb (10μl Biolegend）； 9）以锡箔纸覆盖细胞后，在生物安全柜中室温孵育 20 分钟 ； 10）用 PBS 洗涤一遍，离心1500 rpm x 10分钟（室温）； 11）以 300 μl 2％多聚甲醛的PBS中，4℃ 冰箱中折存,或者直接在 FACS Aria 流式细胞仪上机获取数据； 12）用FIowjo 7.5 对流式数据进行分析。