实验二：淋巴细胞分离实验.pptVIP

实验二 小鼠脾脏淋巴细胞的分离 小鼠脾脏淋巴细胞的分离 目的 原理 实验步骤 注意事项 目的 熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离方法 原 理 脾脏各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 原 理 实验步骤 1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨（研磨同时滴加1640培养液，保持细胞活性） 2. 细胞混合液静置数分钟后吸管吸取，沿倾斜的管壁缓缓加入淋巴细胞分层液上方（Ficoll：血细胞=1：1） 实验步骤 3.2000r/min，离心15min 4.沿管壁周缘轻轻吸取淋巴细胞层移入另一试管中 实验步骤 5.加足量稀释液充分洗涤，1000 r/min离心5min ，弃上清 6. 适量的培养基重悬细胞 ，计数 注意事项 1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 细胞计数 实验步骤 注意事项 实验步骤 1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数 实验步骤 5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104 注意事项 1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数 试验报告要求 原理, 步骤, 结果, 讨论。 * * 外周血 红细胞 粒细胞 单个核细胞 血小板 淋巴细胞 单核细胞 1.093 1.030~1.035 1.075~1.090 Ficoll：1.077±0.001 (PBMC) 1.092 1500rpm, 20℃ , 30min PBMC 红细胞粒细胞 Ficoll 稀释外周血 Ficoll 稀释的血浆、血小板 *