疟原虫镜检血片的制作与染色.ppt

疟原虫镜检血片的制作与染色 血涂片的制作 1. 材料 (1) 载玻片：玻片使用前应清洗。新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中10~20分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，凉干，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水中1~2小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中1~2小时，逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净，再将玻片擦干擦亮。洗净的玻片每10~20张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。 (2) 采血针：使用一次性釆血针。 (3) 玻片盒： (4) 75％乙醇棉球：用于采血前后的消毒。 (5) 标签记号笔：用于玻片上书写号码。 2. 采血部位及取血方法 采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。先用75％乙醇棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1~2mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。 3. 涂制厚血膜 取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用该端中部刮取血液1~1.5μl。将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.8~1cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到5~10个白细胞为宜）。 厚血膜的位置，位于玻片右1/3处。 厚血膜外观：圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。 4.推制薄血膜 用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25~35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳。 薄血膜外观：舌状厚薄均匀，无划痕。 位置：位于玻片1/2～1/3处。 5. 厚、薄血膜的位置 每张载玻片上可做1个薄血膜和1个厚血膜，如图 5. 染色前血膜的保存 血膜制成后，立即将受检者号码写在玻片上，血膜朝下插入直竖的标本盒内，让血膜自然干燥后才能染色。 血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。不能及时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置室温中1~2小时后取出血片。 血膜的染色 1. 染色液的制备 疟原虫镜检推荐使用吉氏染液。吉氏染剂不仅适用于厚血膜和批量血膜的染色，而且效果稳定，染色时间和染液浓度对染色结果影响较小，染色后的血膜保存时间较长，同时吉氏染剂能长期保存而不变质，染色技术也易掌握，被推荐使用。 吉氏染液配制： 吉氏粉 5g，甲醇250ml，甘油250ml。将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗净研钵为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，室温内放置，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使用。 2. 染色用水 常用的染液的稀释用水和染色的冲洗用水，是中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水，也可用井水、河水、泉水或雨水。为了使血膜着色较好，应用pH7.0～7.2水效果最佳。 可配制缓冲液用于染液的稀释和染色后的冲洗。配制pH6.6~7.4缓冲液时，先制备好两种贮备液。贮备液Ⅰ为每1 000ml蒸馏水含9.5g 磷酸氢二钠，贮备液Ⅱ为每1 000ml蒸馏水含9.07g 磷酸二氢钾。配制pH6.6~7.4的缓冲液时，将两种贮备液按一定比例混合后，用蒸馏水稀释成各种浓度的溶液。 3. 染色方法 固定薄血膜：要用甲醇或无水乙醇； 厚血膜溶血：用蒸馏水或清水溶血。 少量血片染色：取可取蒸馏水或缓冲液8ml加入吉氏染液10~12滴，混合均匀后，滴在厚、薄血膜上，染色20~30分钟，然后水洗、晾干。 成批血片染色：将血膜朝一个方向插入染色缸中，或每对玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配的2％吉氏染液浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗2~3次，取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上干燥。 血片制作和染色质量评价标准 好血片制作质量: 厚血膜：血量 4.0～5.0ul,位置 玻片右1／3稍偏右,直径 0.8～1.0cm，外观 圆形厚膜均匀。 薄血膜：血量 1.5～2.0 ul，位置 玻片1／2～1／3处，外观 舌状厚薄均匀；染色质量 外观兰紫色；清洁度 外观光洁无油灰。 理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫的胞质呈蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。 制作血膜的注意事项