基因工程实验指导课件.pdf

实验一 大肠杆菌感受态的制备及转化  1. 实验目的 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒 DNA 转入受体细胞的 技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。  2. 实验原理 转化（transformation） ：是将异源 DNA 分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗 传性状的一种手段，是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。进 入细胞的 DNA 分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传 性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切 酶和甲基化酶的突变株。 自然界中多数细菌的转化频率较低， 如大肠杆菌等。 但受体细胞经过一些特殊方法 （如： 电击法，CaCl ，RuCl 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许 2 有外源 DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent cells)  。在一定条件下，将带有外源  DNA 的载体分子与感受态细胞混合，可以使载体 DNA 分子进入受体细胞。常用的转化方 法主要有以下两种：  1）化学法(热击法)；使用化学试剂（如 CaCl ）制备的感受态细胞，通过热击处理将 2 载体 DNA 分子导入受体细胞；  2） 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载 体 DNA 分子导入受体细胞。 进入细胞的 DNA 分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗 传性状。将经过转化的细胞在选择培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带 有异源 DNA 分子的受体细胞。 本实验以 E. coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl 处理受体菌使其处于感受态，然后 2  与 pUC19 质粒共保温，实现转化。pUC19 质粒携带抗氨苄青霉素和 lacZ’基因，因而接受 了 pUC19 质粒的受体菌具有了抗氨苄青霉素的能力，能在含有 amp 的培养基上存活，从 而将转化细胞筛选出来。  3. 仪器、材料和试剂 仪器： 超净工作台，恒温水浴，分光光度计，冷冻离心机，摇床，移液枪， 水 浴 锅 试剂：  LB 培养基（液体、固体） ：胰蛋白胨  10g， 酵母提取物  5g， NaCl   10g， 调 pH7.0。高压灭菌)  1M CaCl (预冷，过滤除菌)  2 1M MgCl (预冷)  2 含 amp 的固体 LB 培养基（琼脂浓度  15g/L） 冰块若干 材料：大肠杆菌菌株：E.coli DH5α 质粒：pUC19 1  耗材： 带盖离心管(预冷)，枪头(预冷)，PE 手套  4. 操作步骤  4.1 感受态的制备  1） 从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落， 接种于 3～5ml LB液体培养中，  37℃振荡培养 12h 左右，至对数生长期。将该菌悬液以 1:100～1:50 转接于 100ml LB 液体 培养基中，37℃振荡培养，当培养液开始出现混浊后，每隔 20～30min 测一次 OD ，至  600 OD ≤0.5 时停止培养。  600 2） 在无菌条件下将细菌转移到一个冰预冷的无菌50mL离心管中， 冰上放置 10min， 使培养液冷却至 0°C。 （从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快）  3）  4°C 2500×g 离心 5min，倒尽培养液，回收细胞。  4） 用 20mL （原体积的 1/5）无菌冰预冷的 0.1mmol/L MgCl 悬浮细胞，4°C 2500×g