高效液相色谱概要.ppt

几种常见检测系统 ① 紫外-可见光吸收光度检测器 ② 示差折光检测器 ③ 荧光检测器 ④ 二极管阵列检测器 ① 紫外-可见光吸收光度检测器 是高效液相色谱中使用最广泛的检测器，只要溶质在紫外可见光区有吸收，一般都可达到很高的灵敏度。 检测器规格：内径1 mm，长10 mm，内部体积8 mL。适于梯度洗脱之用。 特点：a 灵敏度高；b 线性范围宽；c 可做成体积和小的流通池；d 对流动相的流通和温度变化不太敏感；e 易于操作，十分可靠；f 不破坏样品；g 波长可以选择；h 对不同的溶质影响有很大差别； i 可用于梯度洗脱。 ② 示差折光检测器 可连续检测参比池流动相和样品池中流出物之间的折射率差值，因此，它相类似与气相色谱中的热导池检测器，属通用型检测器，特别是溶质对紫外和可见光物吸收的情况。 特点：a 通用型检测器；b 灵敏度低，不能用于痕量分析；c 对温度变化敏感；d 不能用于梯度洗脱；e 不破坏样品。 ③ 荧光检测器 主要应用范围是生物样品、药品、食品、矿物燃料和环境样品。 特点：a 高灵敏度；b 用于可产生荧光的物质或用有荧光基团的试剂可进行衍生化的物质；c 对有些物质的动态线性范围小，一般104；d 如用激光光源可大大提高灵敏度。 ④ 二极管阵列检测器 可得到三维的时间-色谱-吸收光谱图。 特点： a 可进行全波长检测，一次进样可以检测到样品中不同吸收波长下的所有组分； b 光谱分辨率高，可以检测色谱峰的纯度； c 灵敏度高； d 线性范围宽，基线的噪声小。 4 高效液相色谱的固定相和流动相 1 固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0?108 ~1.0?109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5?108Pa。固定相按孔隙深度分类，可 4 高效液相色谱的固定相和流动相 分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。 ①表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。 4 高效液相色谱的固定相和流动相 ②全多孔型固定相 由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗 粒很细（5~10?m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 4 高效液相色谱的固定相和流动相 2 流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 4 高效液相色谱的固定相和流动相 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。 （3）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。 （4）化学稳定性好 4 高效液相色谱的固定相和流动相 （5）低粘度（粘度适中） 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。 选择流动相的原则： 保持色谱柱的稳定性 化学惰性 适合所用的检测器 对样品有一定的溶解能力 清洗、更换方便、毒性小 沸点、粘度等物理性质合适 反相色谱最常用的流动相： 水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。 水－甲醇体系：大约50％水的时候粘度最大 水－乙腈体系：35％水的时候粘度最大。 1 液-液分配色谱法 液液色谱又称液液分配色谱。 在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体