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淋巴细胞的分离、计数 实验目的和要求 掌握 外周血单个核细胞分离的方法 掌握 细胞计数的方法 实验原理 外周血中细胞种类 细胞密度 红细胞和多形核白细胞 1.092 淋巴细胞和单核细胞（PBMC） 1.075-1.092 血小板 1.030-1.035 葡聚糖—泛影葡胺密度梯度离心法： 根据外周血中各种血细胞比重不同使不同密度的 细胞呈梯度分布，从而分离出PBMC。 实验材料 实验方案 结果计算 方法评价 纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上 细胞计数的仪器 注意事项 请将带血的试管，吸管收集放置于实验室后的红色消毒盆中。 值日生负责收集加样枪，计数板，洗耳球，台盼蓝计数液，Hanks’液。打扫实验室卫生。 * * * * * 中山医学院免疫学教研室 2013-04 1. 肝素抗凝血 2. Hank’s液 3. 淋巴细胞分离液（F-H) 4. 水平离心机，加样枪 5. 显微镜，吸管 6. 细胞计数板，台盼蓝计数液 抽取外周血 分离单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）（PBMC） 细胞计数 实验步骤 肝素抗凝静脉血1.5ml 加1.5ml Hank’s液稀释 置于2ml淋巴细胞分离液上 (交界液面：一定不要打乱) 稀释后的抗凝血 淋巴细胞分离液 注意：稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上，使两者形成一个清晰地界面。 用Hank’s液洗、离心 (1000rpm，5min) 重复2次 血浆 分层液 红细胞粒细胞 离心（2000rpm，25min） 淋巴细胞与单核细胞层 注意：细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，勿打破形成的细胞层。 用Hank’s液重悬细胞 取10ul细胞悬液与90ul白细胞计数液或台盼兰计数液混合 取10ul于细胞计数板上 细胞计数 细胞计数板  细胞计数 原则： 数上不数下，数左不数右 长1mm宽1mm 2 2个大方格内细胞总数 单个核细胞浓度（细胞数/ml) ×104×10 = (稀释倍数） 活细胞百分率 = 活细胞数 细胞总数 × 100% 细胞活力检测：（死细胞被染成蓝色，活细胞不着色） 细胞数量： 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞： 血细胞分析仪，临床常用 装有自动显微镜观察系统 自动细胞计数仪 * * * * * *